QUMICA DEL PROCESO DE FIJACIN

DE CLULAS Y TEJIDOS
 MEZCLAS FIJADORAS QUE CONTIENEN
METALES PESADOS
Sales de Mercurio:
La ms comn: bicloruro de mercurio (HgCl2)

En soluciones de HgCl2 podemos describir las siguientes

reacciones:

a) HgCl2 + H2O [Hg Cl]+ Cl + HCl + Cl- + H+

Esta reaccin es reversible en medio cido

b) HgCl2 + H2O + NaCl [HgCl4]=

Al agregar al agua iones cloruro se forma un anin complejo muy
importante en la fijacin de los tejidos
c) HgCl2 + NaOH Hg+ + NaCl + OH

Hg+ en medio alcalino se reduce a Hg0 (precipita).

De acuerdo a lo descrito, si tenemos HgCl2 en solucin acuosa

podramos distinguir las siguientes especies:

[HgCl4]= [HgCl2] [Hg+] [Hg0] [HgCl]

 El pH de una solucin acuosa tiene importancia en el tipo de
especie que se genera cuando se trabaja con (HgCl2).
(Informacin avalada por los estudios realizados por Baker)

Las mezclas fijadoras que contienen HgCl2 se usan

generalmente a un pH 3 a 3.5 (Zenker, Susa), es decir, bajo
el punto isoelctrico de las protenas. En esas condiciones las
protenas se encuentran cargadas positivamente (NH3+) y se
uniran a la especie [HgCl4]= favoreciendo la basofilia del
tejido.
 Se ha demostrado que se pueden establecer uniones entre
grupos aminos a travs de tomos de Hg. Es decir, el Hg es
capaz de actuar como puente de unin entre molculas
pequeas de protenas.
 La reaccin ms conocida del HgCl2 es con los grupos SH de
la cistena. Cerca del punto isoelctrico de las protenas hay
interaccin con el grupo SH (el Hg reemplaza al H del grupo
SH).

Si hay dos grupos SH vecinos ocurre lo siguiente:

 Se bloquea la reactividad de los grupos SH y se forman
puentes de Hg (mercaptido).

Cuando se desea realizar un estudio de protenas ricas en

grupos SH no se deben utilizar fijadores que contengan
sales de mercurio.

Los tejidos que son fijados con soluciones que contienen

sales de mercurio presentan una distribucin al azar de
abundante precipitado negro. El precipitado no altera la
morfologa y es fcilmente eliminado por tratamiento de las
muestras con una solucin de yodo seguida por una solucin
acuosa de tiosulfato de sodio.
 Los fijadores que contienen HgCl2 penetran rpidamente en
el tejido y provocan endurecimiento, el cual se hace excesivo
si el tiempo de fijacin es muy prolongado.

El HgCl2 no se utiliza como fijador simple, sino que forma

parte de muchas mezclas fijadoras, las que considerando las
precauciones pertinentes conservan muy bien la morfologa y
dan buenas coloraciones.
 El HgCl2 tambin puede interaccionar con los grupos OH de
la tirosina.

El grupo OH de la tirosina es bloqueado por el Hg, pero

como esta reaccin se detecta por un cambio de color, se
constituye en una tcnica especfica para reconocer estos
grupos qumicos en las protenas.
 Las mezclas fijadoras que contienen HgCl2 no son utilizadas
en estudios histoqumicos ni en estudios inmunocitoqumicos
o inmunohistoqumicos pues el Hg bloquea los grupos SH de
las protenas que son muy importantes en el sitio activo de
las enzimas y en los sitios de unin antgeno-anticuerpo.
Sales u xidos de cromo
Las ms utilizadas son:

Trixido de cromo (CrO3): precipita las protenas

Dicromato de potasio (K2Cr2O7): no precipita las

protenas.
Se usa siempre en mezclas fijadoras (ejemplos: Zenker,
Helly, etc.). Es muy recomendable para la fijacin de
fosfolpidos, con los cuales interacta, hacindolos
insolubles.
 Si el K2Cr2O7 se disuelve en agua se forma principalmente el
anin dicromato (pH moderadamente cido):

Pero adems estn presentes otras especies:

Cromato cido Cromato

pH cido pH bsico
 La qumica de la fijacin con dicromato de potasio no se
conoce bien.

Se propone que el Cr con carga positiva interacta con

grupos COO- u OH de las protenas. Esto se ha comprobado
experimentalmente bloqueando estos grupos y en estas
condiciones el Cr no se une a los tejidos.

El uso de este tipo de fijadores favorece la acidofilia

(coloracin con colorantes aninicos o cidos).
 SOLUCIONES FIJADORAS QUE CONTIENEN
SOLVENTES ORGNICOS
En fijacin los ms utilizados son:

Metanol: CH3 OH

Etanol: CH3 CH2 OH

Acetona: CH3 CO CH3

Cloroformo: CH Cl3

Se usan en soluciones concentradas (puras) o formando parte de

mezclas fijadoras
 El metanol u otros alcoholes son compuestos altamente
polares, pero menos polares que el agua. La polaridad va
disminuyendo a medida que la cadena se alarga.

En las clulas las protenas se encuentran rodeadas de

molculas de agua las que pueden ser reemplazadas por
metanol u otro alcohol produciendo la deshidratacin de ellas.

Representaciones de una molcula de agua

Las molculas de agua son dipolares Representacin de una

protena globular hidratada
 Si tenemos soluciones concentradas de metanol o etanol, sus
molculas se encuentran asociadas mediante puentes de
hidrgeno.

Ejemplo: metanol

Los puentes de hidrgeno son uniones dbiles, pero son

tantos los puentes que se forman que el efecto final es una
unin ms fuerte.
 Si al metanol se le agrega agua se tienden a formar puentes
de hidrgeno con el agua desapareciendo los polmeros de
alcohol por el efecto disociante del agua (se rompen
puentes de hidrgeno entre las molculas de metanol).
 El agua interacta por puentes de hidrgeno con las protenas. En
presencia de alcoholes se rompen estos puentes de hidrgeno y se
establecen puentes de hidrgeno con el alcohol. El grupo OH del
alcohol tiende a formar puentes de hidrgeno con las protenas.

La protena se deshidrata, ya que el agua pierde centros de carga

efectivos (pierde capacidad de interaccionar con las protenas) y
forma puentes de hidrgeno con el metanol. La protena
deshidratada precipita.

_+
_
Efecto del alcohol en las uniones hidrofbicas:

La estructura terciaria de las protenas est mantenida en

forma importante por las uniones hidrofbicas (tendencia de
grupos no polares a asociarse entre s en presencia de agua).

Los alcoholes por ser menos polares que el agua debilitan

estas interacciones hidrofbicas y en algunos casos las
rompen. Esto conduce a la prdida de la estructura terciaria.
Ej: produce desenrollamiento de protenas globulares
 El etanol por ser menos polar que el metanol produce un gran
debilitamiento o rompimiento de estas interacciones
hidrofbicas.

El metanol produce menos debilitamiento de estas

interacciones, razn por la que se aconseja para fijar glbulos
rojos en frotis (la hemoglobina, protena globular, se altera
menos).
 Al alterarse la estructura terciaria puede cambiar la
reactividad de las protenas. Ejemplos:

El acercamiento de cadenas proteicas permite fuertes

uniones entre cadenas peptdicas lo que produce bloqueo
de grupos reactivos.

Pueden hacerse accesibles nuevos grupos reactivos que

se encontraban en el interior de las protenas.
 SOLUCIONES FIJADORAS QUE
CONTIENEN CIDOS
Los cidos ms utilizados son:

cido actico

cido pcrico
 El cido actico es un cido dbil que se encuentra muy
poco disociado (hay equilibrio entre presencia de monmeros
y dmeros).

Forma dimrica
Fuerza de enlace: 7 a 9 Kcal/mol
A medida que se diluye esta forma va desapareciendo
 Se utiliza generalmente al 5%, agregado a mezclas fijadoras.

Es un cido que no fija las protenas, pero es muy importante

en las fijaciones nucleares ya que precipita las
nucleoprotenas.

Es un fijador muy penetrante y produce un pronunciado

aumento del volumen de las clulas.
 De acuerdo a lo afirmado por Gustavson en 1956, la molcula
de cido actico sin disociar, compite con la unin de
molculas de agua y con grupos reactivos de cadenas
adyacentes de polipptidos para unirse a nivel de los grupos
que forman el enlace peptdico, pudiendo romper
interacciones por puentes de hidrgeno que se establecen
entre cadenas polipeptdicas:

Se rompe el puente de
hidrgeno y el cido actico
interacciona con grupos
reactivos del tejido,
estableciendo nuevos
puentes de hidrgeno.
 Consecuencias:

a)

b)
 El cido pcrico o trinitrofenol: se expende en forma de
cristales amarillos. No es muy soluble en agua (1.41%
peso/peso); es ms soluble en etanol (4.9% peso/peso).

Cuando est seco y se calienta repentinamente se

descompone explosivamente, por esta razn debe
mantenerse hidratado.

El cido pcrico es un fijador coagulante de las protenas y

forma picratos con los grupos amino (NH3+), carboxilos
(COO) e hidroxilos (OH) de las protenas. Algunos picratos
que se forman son solubles en agua.
 El grupo NO2 cuando se encuentra en posicin para con
respecto al grupo OH, tiene un efecto inductivo positivo (atrae
electrones).

Se crea centro de
carga positiva

Enlace covalente dativo

 A pH bajo el punto isoelctrico, el cido pcrico reacciona con
los grupos NH3+ de las protenas (interaccin con grupo NO2
del cido pcrico, en estas condiciones el OH no estara
disociado).

A pH sobre el punto isoelctrico se une a los grupos COO y

OH de las protenas (interaccin con grupo OH del cido
pcrico).

En el punto isoelctrico el cido pcrico interacciona con los

grupos NH3+ y COO- de las protenas.
 El cido pcrico no se usa como solucin simple, sino
formando parte de mezclas fijadoras (Ejemplos: mezcla de
Bouin, Gendre, Rossman, etc.) en las que se utiliza un pH
cido.

Despus de fijar se debe lavar repetidamente las muestras en

etanol de 70, con el fin de sacar el exceso de cido pcrico
que podra influir en la conservacin de las estructuras
celulares y en la capacidad de tincin.

Las muestras no deben ser lavadas en agua despus de

fijaciones con cido pcrico para evitar que se produzca
prdida de picratos (que son solubles en agua).
 El cido pcrico se recomienda para la fijacin de glicgeno,
se forma una malla proteica donde el glicgeno queda
retenido.

PAS PAS/diastasa
 Ejemplo de interacciones qumicas que se establecen
entre los componentes de una mezcla fijadora

Mezcla fijadora de Carnoy:

Metanol (CH3-OH):...................................................60 mL
Cloroformo (CH-Cl3):.30 mL
cido actico (CH3-COOH):.10 mL

Cules especies estn presentes en esta mezcla?

Monmeros de metanol, cloroformo y cido actico

Polmeros de metanol
Dmeros de cido actico probablemente en menor proporcin que los
monmeros
Se originan interacciones por puentes de hidrgeno entre el cloroformo,
metanol y cido actico.
 dmero de metanol cido actico

cloroformol

En la molcula de cloroformo el Cl presenta un efecto inductivo positivo,

es decir, los electrones del carbono son atrados hacia el Cl, crendose
un centro con un Cpositivo. Como consecuencia, esta molcula tiene
un gran poder para formar puentes de H ( ) con el oxgeno o el
nitrgeno.