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ESPECTROSCOPA DE
FLUORESCENCIA,
FOSFORESCENCIA Y
QUIMIOLUMINISCENCIA
MOLECULAR
1. FUNDAMENTOS
BSICOS
2. VARIABLES QUE AFECTAN A LA
FLUORESCENCIA Y A LA FOSFORESCENCIA
3. ESPECTROS DE EMISIN Y EXCITACIN
4. COMPONENTES DE UN FLUORMETRO O
UN ESPECTROFLUORMETRO
5. FOSFORMETROS
FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA
h
CUBETA SELECTOR DETECTOR TRATAM. Y
LECTURA
SELECTOR
FUENTE
EMISION Y QUIMIOLUMINISCENCIA
h
FUENTE Y SELECTOR TRATAM. Y
DETECTOR
ANALITO LECTURA
1. FUNDAMENTOS
BSICOS
La fluorescencia tiene lugar en sistemas qumicos Gaseosos,
Lquidos y Slidos
3p
Las especies moleculares a veces
presentan resonancia fluorescente.
A menudo se obtienen bandas de
E
fluorescencia molecular (o
3s fosforescencia) centradas a
longitudes de onda ms largas que
Radiacin de
la lnea de resonancia
resonancia o
(Desplazamiento de Stokes)
resonancia
fluorescente (vapor E1
atmico de Na)
E
E0
1. FUNDAMENTOS
BSICOS
S1
Energa
Conversin
interna
y
Absorcin Fluorescencia Fosforescencia
externa
Relajacin
S0 vibracional
1 2 3 4
Figura
2
2. VARIABLES QUE AFECTAN A LA FLUORESCENCIA Y A
LA FOSFORESCENCIA
La fluorescencia rara vez es el resultado de la absorcin de radiacin
UV de <250 nm porque es suficientemente energtica para
producir desactivacin por disociacin. Por tanto no se observa
fluorescencia debida a transiciones *. La emisin se restringe a
transiciones * y n*.
La Fluorescencia la presentan con ms frecuencia
compuestos en los que * es la transicin de menor
energa y no la transicin n*.
Los compuestos con posibilidad de transiciones * con
estructuras alifticas y aliciclicas de carbonilo o estructuras
con dobles enlaces muy conjugados presentan
Fluorescencia.
Los sistemas aromticos presentan Fluorescencia.
Fenantren
o
2. VARIABLES QUE AFECTAN A LA FLUORESCENCIA Y A
LA FOSFORESCENCIA
Los heterociclos sencillos como:
O
N
Piridin Furan
a o No presentan fluorescencia. Con
heterociclos con N, la transicin de
S menor energa es n* que se
N
transforma en triplete favoreciendo la
fosforescencia.
Tiofen Pirro
o l
2. VARIABLES QUE AFECTAN A LA FLUORESCENCIA Y A
LA FOSFORESCENCIA
No obstante, si las estructuras estn fusionadas presentan
fluorescencia
N
N
N
Quinolein Isoquinolei Indo
a na l
Fluoren
o
TEMPERATURA: La fluorescencia disminuye con el aumento
de la temperatura porque aumenta el nmero de colisiones
y la probabilidad de conversin externa (desactivacin sin
radiacin).
DISOLVENTES: La fluorescencia de una molcula disminuye
con disolventes que contengan tomos pesados (Br 4C;
CH2I-CH3) porque se favorece la formacin del estado
triplete y por tanto la fosforescencia.
2. VARIABLES QUE AFECTAN A LA FLUORESCENCIA Y A
LA FOSFORESCENCIA
:N H2 +
N H3 Cuanto mayor sea el nmero
de formas resonantes mayor
estabilidad del 1 estado
excitado por lo que se produce
Anilina Ion anilinio fluorescencia en la regin del
pH ms UV.
acido
LOS PROCEDIMIENTOS ANALTICOS BASADOS EN
FLUORESCENCIA REQUIEREN CONTROL ESTRICTO DEL pH.
Filtro de
Atenuador del haz emisin o
monocromador
Fotomultiplicador Fotomultiplicador
de referencia de muestra
Pantalla
4. COMPONENTES DE UN FLUORMETRO O UN
ESPECTROFLUORMETRO
FUENTES
Se necesitan fuentes ms intensas que las utilizadas en las
medidas de absorcin. La sensibilidad es directamente
proporcional a la potencia de salida (P0).
FILTROS Y
MONOCROMADORES
Tanto los filtros de interferencia como los de absorcin han
sido utilizados en los fluormetros. Los espectrofluormetros
estn equipados con monocromadores de red.
DETECTORES
Determinacin de especies
APLICACI inorgnicas
ONES
Determinacin de especies
orgnicas
Determinacin de especies
inorgnicas
Implican la formacin de un
quelato fluorescente y la
Mtodos medida de su emisin.
Se basan en la disminucin de
fluorimtricos
la fluorescencia por la
atenuacin que produce el
analito (aniones).
Los metales de transicin no se suelen determinar por
fluorimetra dado que muchos de ellos son paramagnticos lo
que favorece el cruzamiento de sistemas y porque los complejos
que forman se desactivan por conversin interna. De ah que las
principales aplicaciones inorgnicas sean para metales como Ca,
Al, Be
MTODOS FLUORIMTRICOS SELECCIONADOS PARA ESPECIES
INORGNICAS
Longitud de onda,
nm
Ion Reactivo Absorcin Fluoresce Sensibili Interferenci
ncia dad as
g/mL
Be, Co, Cr,
Al3+ Rojo de alizarina 470 500 0,007 Cu, F-,
R NO3-,Ni, PO43-,
Th, Zr
F- Complejo de Al 470 500 0,001 Be, Co, Cr,
con Rojo de Cu, Fe, Ni,
alizarina R PO43-, Th, Zr
(atenuacin)
B4O72- Benzona 370 450 0,04 Be, Sb
Cd2+ 2-(o- 365 Azul 2 NH3
hidroxifenil)-
benzoxazol
Li+ 8- 370 580 0,2 Mg
Hidroxiquinolein
a
Sn4+ Flavanol 400 470 0,1 F-, PO43-, Zr
Zn2+ Benzona - Verde 10 B, Be, Sb,
6. APLICACIONES DE LOS MTODOS
FOTOLUMINISCENTES
Determinacin de especies
orgnicas
Se suelen determinar especies orgnicas y bioqumicas en
campos como alimentacin, farmacia, clnica,:
Compuestos orgnicos
Enzimas
Coenzimas
Agentes medicinales productos
naturales
Esteroides
Vitaminas
Mtodos
fosforimtricos
Los mtodos fosforescentes y fluorescentes tienden a ser
complementarios
Compuestos Compuestos
fuertemente dbilmente
fosforescentes fluorescentes
6. APLICACIONES DE LOS MTODOS
FOTOLUMINISCENTES
Mtodos
fosforimtricos
Se suelen determinar especies orgnicas y bioqumicas :
cidos nucleicos
Aminocidos
Piridina
Pirimidina
Enzimas
Hidrocarburos del petrleo
Pesticidas
A + B C*
+D
C* C +
h
La instrumentacin requiere de un recipiente adecuado de
reaccin y un tubo fotomultiplicador. La fuente de radiacin
es la reaccin qumica entre el analito y el reactivo. Sin selector
de longitudes de onda.
Estos mtodos son muy sensibles debido a la ausencia de ruidos.
Los lmites de deteccin estn determinados por la pureza del
reactivo y son del orden de la ppb.
7.
QUIMIOLUMINISCENC
Determinacin de gases contaminantes atmosfricos como O3,
IA
xidos de nitrgeno y compuestos sulfurados.
NO + O3 NO2*
+ O2
NO2* NO2 + h ( = 600 a
2800 nm)
Para aplicaciones en fase lquida se utilizan sustancias
quimioluminiscentes que contienen el grupo:
- CO-NH-
O NHR
NH2
C
NH COO-
+ 2OH- + O2 N2 + H2O + + h
NH COO-
C
Luminol O