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ENZIMOLOGIA

TM. Alberto Vega Flores


Hospital III Puno Essalud
Generalidades
Las reacciones mediadas por enzimas se denominan
reacciones enzimticas.
Como todos los catalizadores, las enzimas funcionan
disminuyendo la energa de activacin de una reaccin.
Las enzimas difieren de otros catalizadores por ser
ms especficas.
No todos las enzimas son protenas, pues algunas
molculas de ARN son capaces de catalizar reacciones
(como las ribozimas).
E+S

E+P
Tiempo de la reaccin
C6H12O6 CO2 + H20 + ATP

Espontneamente Tardara 2,000,000 de Aos


Enzima - Catalizador
Tanto la enzima como el catalizador aceleran
la velocidad de una reaccin qumica.
Una enzima puede transformar 1000
molculas de sustrato/ segundo
Las enzimas tienen 3 propiedades que los
catalizadores NO tienen
Especificidad por el sustrato
Se inactivan por desnaturacin
Pueden ser reguladas
No alteran el equilibrio qumico de la reaccin.
Las enzimas no son consumidas por las
reacciones que catalizan.
ENZIMAS
Inactivacin de
la enzima

Estructura
globular

Hervir con HCl


Tripsina
Temperatura elevada
pH extremo

Funcional Inactiva
Generalidades
La actividad de las enzimas puede ser afectada por
otras molculas. Los inhibidores enzimticos son
molculas que disminuyen o impiden la actividad
de las enzimas, mientras que los activadores son
molculas que incrementan dicha actividad.
Los Zimgenos son protenas que requieren
desprenderse de un fragmento pequeo para
convertirse en enzimas activas
Generalidades
Algunas enzimas requieren la unin de
molculas no proteicas denominadas
cofactores para poder ejercer su actividad

Inactiva Los Grupos Prostticos

Las Coenzimas
PARTE PROTEICA NO PROTEICA
Apoenzima Cofactor (activador)

Holoenzima (activa)
Las enzimas que requieren un cofactor pero no lo tienen
unido son denominadas apoenzimas (inactiva)

Una apoenzima junto con un cofactor es denominada


holoenzima (que es la forma activa).
Cofactores

Cofactores pueden ser:


Compuestos inorgnicos:
Grupos prostticos
Compuestos orgnicos:
Grupos prostticos, que se unen fuertemente
a la enzima.
Coenzimas, Se unen de una manera
transitoria y disociable a la enzima.
Los grupos prostticos
Tieneestrecha y estable unin hacia la
estructura de una protena mediante
fuerzas covalentes o no covalentes.
Fosfato de piridoxal, flavinamononucleotido
(FMN)
Flavina adenina dinucleotido (FAD)
Pirofosfato de tiamina
Biotina
Iones metlicos de Co, Cu, Mg, Mn y Zn.
Las coenzimas
Las coenzimas sirven como
transbordadores o agentes de
transferencia de grupo reciclables, que
transportan muchos sustratos desde su
punto de generacin hacia su punto de
utilizacin
S: PM 250, 0.8 nm

Cofactor
E: PM 100000, 7 nm
Inorgnico:
Fe2+, Mn2+, Zn2+,etc.

Orgnico:
Orgnico:
Coenzimas
Coenzimas
NAD,
NAD,
FAD,
FAD,
CoASH.
CoASH.
GrupoProsttico
Grupo Prosttico
GrupoProsttico
Grupo Prosttico
Algunas enzimas requieren metales para
mejorar su actividad
Enzimas que requieren elementos
inorgnicos
Citocromo oxidasa Fe2+, Fe+,
Catalasa, peroxidasa
Citocromo oxidasa Cu2+
DNA polimerasa
Anhdrasa carbnica Zn2+
Alcohol deshidrogensa
Hexoquinasa Mg2+
Glucosa 6-fosfatasa
Arginasa Mn2+
Piruvato quinasa K+, Mg2+
Ureasa Ni2+
Nitrato reductasa Mo2+
Coenzimas: Actan como transportadores eventuales de
tomos especficos o de grupos funcionales
Coenzimas Entidad transferida
Pirofosfato de tiamina . Aldehdos
Dinucletido de flavina y adenina. tomos de hidrgeno
Ion hidruro (H-)
Dinucletido de nicotinamida y de adenina

Coenzima A . Grupos acilo


Fosfato de Piridoxal . Grupos amino
5-Desoxicobalamina (Coenzima B12) tomos de H y grupos
alquilo
Biocitina . CO2
Tetrahidrofolato . Otros grupos
monocarbonados
Coenzimas

Adenosine Triphosphate (ATP)

Coenzyme A (CoA)

Nicotinamide Adenine
Dinucleotide (NAD+) Nicotinamide Adenine Dinucleotide
Phosphate (NADP+) Flavin Adenine Dinucleotide (FAD)
El NAD es una coenzima aceptora de H

Sustrato
oxidado
Enfermedades
VITAMINAS FUNCIONES
carenciales
C (cido Coenzima de algunas peptidasas.
Escorbuto
ascrbico) Interviene en la sntesis de colgeno

Coenzima de las descarboxilasas y de


B1 (tiamina) las enzima que transfieren grupos Beriberi
aldehdos
B2 Constituyente de los coenzimas FAD y Dermatitis y lesiones
(riboflavina) FMN en las mucosas
B3 (cido Fatiga y trastornos del
Constituyente de la CoA
pantotnico) sueo
B5 (niacina) Constituyente de las coenzimas NAD y Pelagra
NADP
B6 Interviene en las reacciones de
Depresin, anemia
(piridoxina) transferencia de grupos aminos.
B12 Coenzima en la transferencia de grupos Anemia perniciosa
(cobalamina) metilo.
Coenzima de las enzimas que
Biotina transfieren grupos carboxilo, en Fatiga, dermatitis
metabolismo de aminocidos.
Generalidades
Sitio cataltico o centro activo: Es la regin
que contiene alrededor de 3 a 4 aminocidos
y que est directamente involucrada en la
catlisis.
Las enzimas tambin pueden tener sitios con
la capacidad de unir cofactores, o de unir
pequeas molculas, como los sustratos o
productos de la reaccin catalizada.
Generalidades
Varias enzimas pueden atacar a un mismo
sustrato y dar productos diferentes.

HEXOKINASA GLUCOSA P1

GLUCOSA GLUCOSA P2
OXIDASA
Un grupo enzimas puede atacar a un mismo
sustratos y tener un mismo producto (isoenzimas)
Generalidades
Isoenzimas o Isozimas
Son formas moleculares diferentes de una misma
enzima
Catalizan la misma reaccin
Ejemplo: Lactato deshidrogenasa:
LDH 1
LDH 2
LDH 3
LDH 4
LDH 5
Se diferencian por su movilidad electrofortica
Generalidades
Factores que afectan la actividad enzimtica:
Concentracin de la enzima
Concentracin de del sustrato
Temperatura
pH
Efecto de inhibidores y activadores.
Etapas de la reaccin enzimtica
Enzima

Sustrato

Sitio activo
Una enzima puede unir dos sustratos
en su sitio activo
Teoras de la accin enzimtica, 1
Modelo de Llave y Cerradura (Emil Fischer)

Substrato y enzima se acoplan de forma estereospecfica,


de la misma manera que una llave se ajusta a su
cerradura.

Modelo aceptado durante mucho tiempo; hoy se


considera insuficiente al no explicar algunos fenmenos
de la inhibicin enzimtica
Modelo de Llave y Cerradura (Emil Fischer)
Teoras de la accin enzimtica, 2
Modelo de Ajuste Inducido (Koshland)

Tanto la enzima como el substrato sufren una


alteracin en su estructura por el hecho fsico de la
unin.

Est mucho ms de acuerdo con todos los datos


experimentales conocidos hasta el momento.
Modelo de Ajuste Inducido (Koshland)
Teoras de la accin enzimtica, 3
Estabilizacin del Estado de Transicin

La teora del Ajuste Inducido se ampla en la actualidad


definiendo la accin enzimtica como

Segn lo cual, el Centro Activo enzimtico es en realidad


complementario no al substrato o al producto, sino al
estado de transicin entre ambos.
Clasificacin y nomenclatura

Clasificacin de enzimas por Grupos

EC 1.x Oxidorreductasas
EC 2.x Transferasas
EC 3.x Hidrolasas
EC 4.x Liasas
EC 5.x Isomerasas
EC 6.x Ligasas
Clasificacin y nomenclatura
Grupo 1: Oxidorreductasas
Catalizan reacciones de oxidorreduccin, en que tomos de
oxigeno hidrogeno son trasladados entre molculas:
Ared + Box Aox + Bred
AH2 + B A + BH2
Precisan la colaboracin de las coenzimas de
oxidorreduccin (NAD+, NADP+, FAD) que aceptan o ceden
electrones. Tras la accin cataltica, estas coenzimas
quedan modificadas en su grado de oxidacin, por lo que
deben ser recicladas antes de volver a efectuar una nueva
reaccin cataltica.
Ejemplos: Deshidrogenasas, peroxidasas.
Clasificacin y nomenclatura
Grupo 2: Transferasas
Catalizan reacciones de transferencia de
tomos grupo de tomos entre molculas:

A-X + B A + B-X
Transfieren grupos activos (obtenidos de la ruptura
de ciertas molculas) a otras sustancias receptoras.
Suelen actuar en procesos de interconversin de
monosacaridos, aminocidos, etc.
Ejemplos: transaminasas, quinasas.
Clasificacin y nomenclatura
Grupo 3: Hidrolasas
Catalizan reacciones de hidrlisis con la consiguiente
obtencin de monmeros a partir de polmeros. Actan
en la digestin de los alimentos, previamente a otras
fases de su degradacin. La palabra hidrlisis se
deriva de hidro 'agua' y lisis 'disolucin'.
Ejemplos: glucosidasas, lipasas, esterasas.

A-B + H2O A-OH + H-B


Son las ms comunes en el dominio de la tecnologa enzimtica
Clasificacin y nomenclatura
Grupo 4: Liasas
Catalizan reacciones reversibles en las que se
eliminan grupos H2O, CO2 y NH3 para formar un
doble enlace o aadirse a un doble enlace.
Ejemplos: descarboxilasas, liasas.

A-B A+ B
Clasificacin y nomenclatura
Grupo 5: Isomerasas
Actan sobre determinadas A B
molculas obteniendo o
cambiando de ellas sus
ismeros funcionales o de
posicin, es decir, catalizan la
racemizacin y cambios de
posicin de un grupo en
determinada molcula
obteniendo formas isomricas.
Suelen actuar en procesos de interconversin.
Ejemplo: epimerasas.
Clasificacin y nomenclatura
Grupo 6: Ligasas
Catalizan la unin de dos grupos qumicos (enlace) a
expensas del acoplamiento e hidrlisis de un nucletido
trifosfato (molculas de alto valor energtico) como el
ATP(ATP, GTP, etc.).

A + B + ATP A-B + ADP + Pi


6.1.x - Forman enlaces C-O
Clasificacin 6.2.x - Forman enlaces C-S
de las ligasas: 6.3.x - Forman enlaces C-N
6.4.x - Forman enlaces C-C
6.5.x - Forman enlaces steres fosfricos
6.6.x - Actan sobre enlaces N-metal
Cintica Enzimtica
Cintica Enzimtica
La cintica enzimtica es el estudio de cmo las
enzimas se unen a sus sustratos y los transforman
en productos.
Es el anlisis cuantitativo del efecto de cada uno de
los factores que intervienen en la actividad
enzimtica, que se evala a travs de la velocidad
de la reaccin catalizada.
Las variables ms importantes son:
Concentracin de enzima, sustratos y productos
(incluyendo inhibidores y/o activadores)
PH y Temperatura
Cintica Enzimtica
Ella est basada en la medicin de la velocidad de
reaccin.
La velocidad de reaccin disminuye continuamente
a partir de un valor mximo inicial. Esto se puede
deber a:
Desaturacin de la enzima con sustrato, por disminucin
de la concentracin del sustrato
Inactivacin de la enzima por su inherente inestabilidad
Inhibicin por el producto
Desplazamiento del equilibrio, si la reaccin es
reversible
E+S ES EP E+P
Baja
concentracin
de sustrato

ALTA
concentracin
de sustrato
SATURACION
Equilibrio de la reaccin enzimtica
. . .
Efecto de la concentracin de sustrato

vmax
. .
.
.
. [s]
Hay un nmero limitado de sitios en la enzima para fijar substrato;
una vez que estn ocupados todos, por mucho que aumente la [s], la
velocidad permanecer constante (Vmax)
Una cintica hiperblica implica un proceso saturante:
Relacin entre Km y Vmax
Michaelis y Menten
Velocidad de la reaccin (v)
Vmax

Vmax/2

Km Concentracin de Sustrato [S]

La constante Km de Michaelis Menten es la [s] a la cual la velocidad


es la mitad de la velocidad mxima (Vmaxl2).
A mayor Km, menor es la afinidad de la enzima por el sustrato
A menor Km mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato
Definicin Actividad Enzimtica

Es el nmero de moles de sustrato que


reaccionan para formar producto, por mol de
enzima y por unidad de tiempo. Esto supone
que la enzima est plenamente saturada con
sustrato y por tanto que la reaccin se efecta
con su mxima rapidez
El ndice de recambio muestra la eficiencia
impresionante de la catlisis enzimtica
Efecto del pH en la ENZIMA

Cada enzima tiene un pH ptimo para su actividad


El pH afecta las interacciones inicas
Efecto de la temperatura en la ENZIMA
Aumento de la Desnaturacin
velocidad por calor

15 40 75

Temperatura
Cada enzima tiene una temperatura ptima.
Inhibicin enzimtica
Los inhibidores son molculas que regulan la
actividad enzimtica, inhibiendo su actividad.
Pueden clasificarse en:

Reversibles
Irreversibles.
Las irreversibles se unen covalentemente a la
enzima sin posibilidad de revertir la modificacin.
Las reversibles se unen de forma reversible a la
enzima.
Los inhibidores isostricos pueden ser de dos tipos:

1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre,


con el complejo enzima-substrato o con ambos:

E+I EI

ES + I ESI

2. Inhibidor irreversible: modifica qumicamente a la enzima:


E+I E@
Algunos tipos de inhibidores irreversibles

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfricos

3. Ligandos de metales

4. Metales pesados
Inhibicin enzimtica
Las reversibles se clasifican en:
Competitivas; el inhibidor se une al sitio activo de la enzima,

impidiendo la unin del sustrato.


Acompetitivas; el inhibidor no puede unirse a la enzima libre,

sino al complejo ES. Con el complejo EIS la enzima queda


inactiva.
Mixtas; el inhibidor se une a un lugar diferente del sitio activo,

afectando la unin del sustrato.


No competitiva en realidad no es ms que una variante de la ya

mencionada inhibicin mixta. No afecta la unin del sustrato.


Inhibicin enzimtica
Molculas que disminuyen la actividad enzimtica, a
travs de interacciones con el centro activo u otros
centros especficos
Esta definicin excluye todos aquellos agentes que
inactivan a la enzima a travs de desnaturalizacin de la
molcula enzimtica
De esta forma, habr dos tipos de inhibidores:
Isostricos: Ejercen su accin sobre el centro activo
Alostricos: ejercen su accin sobre otra parte de la
molcula, causando un cambio conformacional con
repercusin negativa en la actividad enzimtica.
Inhibicin Competitiva
Inhibicin Competitiva
Sin inhibidor

Con inhibidor

El inhibidor competitivo
aumenta la Km

Km Km
Sin con
inhibidor inhibidor
Inhibidor No Competitivo

Se une a un lugar diferente del sitio


activo la enzima
Se une a la enzima libre y tambin al
complejo enzima-sustrato
Por accin del inhibidor disminuye la Vm

pero el valor de Km no se altera


Inhibicin No competitiva

Disminuye la Vmax pero el valor de Km no se altera


Inhibicin Acompetitiva

Como I solo se une a ES estimula la formacin de


ES y, por tanto, incrementa la unin del sustrato a la
enzima, disminuyendo Km. Sin embargo, el
complejo ESI no conduce a productos y disminuye
el Vmax.
Inhibidor y Activador
Principios del anlisis de enzimas

La alteracin de la concentracin srica de


una enzima determinada, nos orienta sobre
los tejidos ms probablemente afectados.
Es la aplicacin del conocimiento de las

enzimas al diagnstico, tratamiento y


pronstico de algunas enfermedades.
Con frecuencia se relacionan los valores de

dos o ms enzimas distintas para realizar un


diagnstico ms preciso
Principios del anlisis de enzimas
La concentracin srica de las enzimas es muy
baja, pero debido a su alta capacidad de catlisis,
se puede determinar su actividad.
Y se asume que
ACTIVIDAD ENZIMATICA CONC. DE ENZIMA

Enzimologa Clnica se basa en la evaluacin


de la actividad cataltica in vitro
Principios del anlisis de enzimas

Existen dos formas de evaluar la actividad


enzimtica:
Por la Aparicin de productos
Por la Desaparicin del sustrato
Las dos formas se evalan bajo condiciones
controladas de pH y Temperatura. (los
ptimos para la enzima)
Principios del anlisis de enzimas

La actividad enzimtica se expresa como


Unidades Internacionales por unidad de
volumen (UI/mL, UI/L)

UI = Cantidad de enzima que transforma un


micromol de sustrato / min.
En condiciones estndar previamente
establecidas
Clasificacin cintica
Cintica de Primer Orden: La relacin entre la velocidad y
la concentracin de sustrato es directamente proporcional.
Cintica de Segundo Orden: La velocidad es proporcional
al cuadrado de la concentracin de Sustrato.
Cintica de Cero Orden: La velocidad es independiente,
es decir, no cambia si modificamos la concentracin de
sustrato.
Cintica Hiperblica: Para una enzima, si aumentamos la
concentracin de sustrato, la velocidad de la reaccin se
conforma de esta forma
Clasificacin cintica

1. En una reaccin, si se tiene


Act Indep de [s] poco sustrato, se habla de
una cintica de primer orden.
Orden cero 2. Si se sigue aumentando el
sustrato, se tiene una cintica
2do orden de orden mixto o indefinido.
o mixto 3. Con un exceso de sustrato,
se ha alcanzado la velocidad
1er orden mxima, se ha vuelto
Act Dep de [s]
constante. Todos los sitios
catalticos estn ocupados, la
enzima est saturada.
Medida de la actividad enzimtica
Es necesario realizar las determinaciones
enzimticas en la fase lineal
Factor limitante es la concentracin de la
enzima
Condiciones de reaccin son ptimas
(exceso de sustrato, pH, Temperatura, etc.)
Todas las reacciones deben tener cintica de
orden cero.
La [s] debe ser 100 veces el valor del Km
Tcnicas de evaluacin enzimtica

Se emplean mtodos espectrofotomtricos:


Si el producto absorbe luz a cierta , se
registra el aumento de la Absorbancia
Si el sustrato absorbe luz a cierta , se
registra la disminucin de la Absorbancia
Tambin es posible analizar la variacin de
algn cofactor u otro componente de la
reaccin.
Tcnicas de evaluacin enzimtica

Frecuentemente se emplea la aparicin o desaparicin de


NADH o de NADPH como evaluacin enzimtica.

Muchas determinaciones enzimticas pueden acoplarse con


reacciones que utilizan NAD+ o NADP+ (no absorben a
340 nm) como coenzimas, en virtud de que NADH y
NADPH absorben a 340 nm
NAD + NADH NADH NAD +
NADP + NADPH NADPH NADP +
Cuando NAD+ se reduce Cuando NADH se oxida
Aumenta la absorbancia a 340nm Disminuye la absorbancia a 340nm
Tcnicas de evaluacin enzimtica

Se emplean mtodos espectrofotomtricos


Pueden ser de dos tipos:

Mtodos a Punto Final


Mtodos Cinticos
Tcnicas de evaluacin enzimtica

Mtodo a Punto Final


Se ponen en contacto los reactivos y la
muestra (sustrato y enzima)
Posterior a un perodo de incubacin se
determina la absorbancia a la indicada (A i )
Al cabo de un tiempo establecido se detiene la
reaccin y se mide la absorbancia final. (Af )
Tcnicas de evaluacin enzimtica
Mtodo cintico
Periodo lag (fase de retardo), Se ponen en contacto
los reactivos y la muestra (sustrato y enzima) para
que se estabilice la reaccin.
Se determina la absorbancia a la indicada (Ai)

Se realizan lecturas cada minuto durante 3-5


minutos. Para estar seguros de que se est
trabajando en la fase lineal de la curva.
Consideraciones Importantes
No emplear sueros hemolizados
No emplear muestras que hayan sido
congeladas y descongeladas varias veces
Si se realiza transporte de la muestra desde
un lugar lejano al laboratorio se debe
conservar en fro sin congelar
RESUMEN

Las enzimas son protenas que catalizan


las reacciones biolgicas
Presentan especificidad por su sustrato

Cada enzima presenta dos parmetros


importantes Vmax (saturacin de la
enzima) y la Km (medida de la afinidad
por el sustrato)
RESUMEN
La actividad enzimtica puede ser inhibida,
por inhibidores competitivos (similares al
sustrato) o por inhibidores no competitivos.
La temperatura y el pH afectan a la enzima

en su actividad cataltica.
Algunas enzimas requieren de coenzimas

y/o cofactores para su actividad.


USO CLNICO DE LOS ENZIMAS.
En el Laboratorio Clnico:
Pueden utilizarse para la cuantificacin de niveles de metabolitos en
fluidos orgnicos
La urato oxidasa / cido rico en sangre
La glucosa oxidasa / glucosa en sangre
Los niveles de colesterol / colesterol oxidasa.
La lipasa se emplea para medir los niveles de triglicridos.

Adems las Enzimas nos pueden brindar valiosa informacin acerca del
estado de un rgano por ejemplo: El Hgado El Corazn Los
Msculos