Coloracin

TM Patricia Toledo R.
9000 aos de antiguedad
Antecedentes

Tela Herodes del primer

siglo antes AC.
b) Se observa la parte
alta de un recipiente de
cermica descubierto en
Tel Shiqmona cerca de
Haifa en Israel (Siglos
VIII a IX AC).
Prpura de Tilo (1700 a.c

Rubia, Alizarina .
Imperio Romano
Orcena
Tejidos pigmentados
 Introduccin
1714. Van Leeuwenhoek usa azafrn de
vino para destacar fibras musculares.
Uso de colorantes naturales.

1856 Inicio colorantes derivados de

anilinas
 Fundamento

Los tejidos tienen la propiedad de

fijar e incorporar de modo
variable diversas sustancias
coloreadas llamadas colorantes.
 Color
Si refleja toda la radiacin la retina lo
percibe como blanco, y si absorbe todo en
negro.
El color visible es el complementario del
color espectral absorbido.
 Color

Absorciones
parciales los
fotorreceptores
retinianos
captan el espectro
complementario de
la
radiacin absorbida,
producindose la
percepcin de los
colores.
 COLORANTE
Una sustancia que, puesta en
contacto con un soporte
adecuado, se une a l de forma
perdurable transmitindole su
color.
 Clasificacin por origen:
NATURALES ARTIFICIALES
Siglo XIX

INDIGO
 CROMOFOROS

Los radicales responsables de la

modificacin molecular a la que
se debe la aparicin del color
Estructura de los colorantes
Soporte bsico de los colorantes.
Anillo Quinoide en resonancia.
Resonante absorve en UV
Fijo en espectro visible.
Quin lo fija?: los cromforos
 Tres anillos fusionados
Tres anillos benceno. Antraquinona

TIAZINA
Xantenos
 Cromforos
C=C Etileno

C=O Carbonilo

C=S Tiazlico

C=N Imino

N=N Azoico

N=O Nitroso

NO 2 Nitro
 CROMOGENO

Anillo
quinoide

Cromgeno

Cromforo
 AUXOCROMO
POTENCIADORES DEL COLOR.
Poseen carga elctrica, lo que da carcter
cido o bsico a los colorantes.
Son responsables que un colorante tenga
mayor o menor afinidad por estructuras.
Estos grupos le confieren la capacidad de
disociarse electrolticamente o de formar
sales con los tejidos.
 Grupos auxocromos
1. Radical hidroxilo -OH
2. Radical carboxilo -COOH
3. Radical amino NH2
4. Radical sulfhidrilo -SH
5. Cromo
6. Hierro
7. Aluminio
8. Molibdeno
 CLASIFICACION SEGN
CROMOFORO
1. Nitrocolorante
2. Colorante azoico
3. Antraquinona
4. Acridina
5. Oxacina tiacina acina
6. Trifenil metano
7. Xanteno
8. Ftalocianina de cobre
Colorantes nitrados y nitrosados

El ms simple es
2,4,6 trinitrofenol o
cido pcrico.
 Colorantes azoicos

Monoazoicos:
orange G, Ponceau
de xilidina
Poliazoicos: rojo
congo, sudn rojo y
negro.
 Derivados de antroquinona
Rojo de alizarina S.

Radical Carbonilo C=O

 Derivados de acridina.

Son derivados de la
molcula de acridina
y que contienen un
cromforo >C=N-
(imino)
Ej. Naranja de
acridina
 Derivado de iminas +
Poseen DOS grupos cromforos, se
clasifican:
1.Derivados Oxacnicos: C=N + C=O
2.Derivados Tiacnicos: C=N + C=S
3.Derivados Acnicos: C=N + C=N

IMINO C=N; CARBONILO C=O; TIAZOLICO C=S

Violeta de cresilo.
Derivado oxacnico

IMINO

CARBONILO
Derivado tiacnico. Piel A. de
toluidina

C=S TIAZOILICO
 Derivado acnico

Rojo Neutro
 Derivados de difenilmetano y
trifenilmetano

Su grupo cromforo es >C=N (imino)

Los colorantes de ste grupo son cidos o
bsicos, dependiendo de los auxocromos
vinculados a la molcula.
 Verde luz

Fuscina
 Derivados del Xanteno
Con cromforos
variables, entre los
que se encuentra
pironina, eosina,
rodamina y
sulfaftalena.
eosina
Eosina Y
 Colorantes derivados de
ftalocianinas
Contienen 2 a 4
grupos isotiouronio
alrededor de un
tomo de cobre para
formar una molcula
que recuerda
vagamennte el anillo
hem.
Ej. Azul y amarillo de
alcian
MECANISMOS GENERALES DE
COLORACION

FISICO
FISICO - QUIMICO
HISTOQUIMICO
 MECANISMO FISICO
. Tinciones de grasas.
colorante es ms soluble en el tejido
que en el disolvente

Impregnaciones:
una precipitacin selectiva se forman
agregados insolubles, quedando
atrapado entre la malla de clulas y
fibras que constituyen los tejidos
 MECANISMO FISICO-
QUIMICO
formacin de uniones
intermoleculares por atraccin
electroesttica (cargas contrarias) o
por fuerzas de tensin superficial
(debidas a las fuerzas de gravitacin
generadas al disponerse las
molculas muy prximas entre si)
MECANISMO HISTOQUIMICO
estn basados en el desarrollo de
una reaccin qumica entre el
colorante (comnmente un
leucoderivado) y la estructura objeto
de tincin de forma que al
interaccionar ambos produce un
nuevo cromgeno responsable del
color obtenido.
Tipos de Coloraciones

Progresivas

Regresivas.
Diferenciador
Diferenciacin

Se extrae exceso de colorante con:

Agua
Alcoholes
cidos
Bases
Soluciones metlicas
COMO SE UNE EL
COLORANTE AL
SUSTRATO?
 PARTICIPAN
RELACIONES ELECTROESTATICAS
ENLACES COORDINADOS
MORDIENTES
QUELANTES
PUENTES DE HIDROGENO
INTERACCIONES HIDROFOBICAS
IMPREGNACIONES
Temperatura
 Unin electroesttica

Carga + Carga -

Sal insoluble
Atraccin electrovalente. Enlace inico.

Dye cationico Dye anionico

H3N+ SO3-
OSO3- NH3+

proteoglicano
protena
Residuos cidos de los tejidos

Sulfatos
Fosfatos

Carboxilos

Fenoles
 Efecto de pH.

Sulfatos, Fosfatos y
pH 10 Carboxilos ionizados

Sulfatos y fosfatos
pH 5-7 ionizados.

pH -de 4 Solo sulfatos ionizados.

 Efecto pH
pH cido

H alta
Aminos Fuertes
cantidad Ionizados tinciones de
citoplasma

pH cido Eosina
 Efecto pH

NH3+ AZUL DE
METILENO +
T
E
J COO -
I
EOSINA -
D
O NH3+
 Efecto de sales

NH3+
Cl-
T
E
J COO -
I
D
O NH3+ Cl-
Mordientes

Mordientes: iones metlicos

Unen covalentemente.
Generan complejos de
Coordinacin.
Sales di o tri valentes
Alumbre aluminio y potasio
Mordientes metlicos: alumbres
Aluminio

Hierro
Enlace coordinado
Cromo

Molibdeno
 Mordiente

ANTES DURANTE
 Mordientes
Colorante Mordiente
 ENLACE COVALENTE
Se forma entre el auxocromo y el sustrato (grupos OH
o amino)

COMPLEJO COLORANTE + MORDIENTE +

SUSTRATO.

Enlace muy fuerte

 Puentes de Hidrgeno
Unin dbil

Soluciones acuosas

Altamente selectivos

pH independientes
EJ Coloracin de Rojo Congo.

NH3+ NH3+ CL-

T Azul de T
E metileno E Azul de
J + J
COO - COO - metileno
I I +
D D
O O
NH3+ NH3+ CL-
 Fuerzas de Vander Waals
Atracciones electroestticas entre electrones de un tomo y
el ncleo de otro.

Distancia hasta 0.12-0.2nm

Importante para tinciones de fibras elsticas.

Son ms importantes en la selectividad que en unin.

 Interacciones Hidrofobicas

Oil Red

Disolucin Diferencial
 IMPREGNACIONES
en una impregnacin se forman
agregados metlicos insolubles que
quedan retenidos en el tejido gracias a la
malla molecular creada en el proceso de
fijacin.
Colorantes nucleares

Hematena + laca

Hematena NO
lacada
 COLORANTE
Hematoxilina, cristales rosado-
amarillentos solubles en agua y alcohol.
 HEMATOXILINAS

COLORANTE + SOLVENTE

OXIDANTE

GRUPOS AUXOCROMOS

SOLVENTE GENERAL

pH
 Agentes Oxidantes
MADURACION DE LA HEMATOXILINA
Agentes:
Oxigeno ambiental (4 A 6 semanas)
Oxido Rojo de Mercurio
Yodato de Sodio/ Potasio
Permanganato de Potasio minutos
Dicromato de Potasio
Clorato de Potasio
 Maduracin Inducida

Crucial tiempo de accin y

cantidad de agente oxidante.

Generacin de leucoderivado
(exceso)

Coloracin parda e
inespecfica (sobre oxidacin)
 Oxidacin inducida
Para 1 gr de Hematoxilina, se usa:

Oxido de mercurio 0,5 g

Yodato de sodio 0,05g
Permanganato de Potasio 0,177g
Dicromato de Potasio 0,28g
Clorato de potasio 0,11 g
Hematoxilina sobre oxidada
 Estabilidad Hematena

SOLVENTE ESTADO
acuosa neutra Sobreoxidacin
glicerina-alcohol mayor duracin
Bsicas aceleran oxidacin
cidas retardan oxidacin
 AUXOCROMOS
OH
COOH
NH2
SH
IONES METALICOS: Cr, Al, H,
Mb, Pb, Cu.
 GRUPOS AUXOCROMOS

Incrementar capacidad tintorial

Afinidad por ncleos celulares

Carcter fuertemente bsico

Sales metalicas bi y trivalentes

 AUXOCROMOS= ALUMBRES
ALUMBRE HEMATOXILINA
Alumbre potasio/aluminio H. HARRIS

Alumbre potasio / amoniaco H. MAYER

Alumbre amoniacal H. DELAFIELD

Alumbre potasio / amoniaco H. EHRLICH
 ALUMBRE
ALUMINIO/POTASIO
HEMALUMBRE

pH -3 rojo
pH 1-5 amarilla
pH +6 azul violcea
 FORMACION LACA

Requiere de que en el colorante

coexistan un grupo fenlico y
carboxlico en posicin orto,
desplaza molcula de agua y
forma la laca.
 FORMACION LACA
Existira una atraccin electroesttica,
pero los complejos lacados son estables
formacin de enlaces covalentes, que se
genera entre el catin + aniones del tejido
= laca/quelato

Catin cromo y fierro mas estable que

aluminio.
 Tincin Nuclear

Grupos fosfricos
Lacas de
Hematoxilina Histonas

Arginina
Hematoxilina
no lacada Lisina
 Selectividad de la tincin

ACIDIFICANDO

Acido actico glacial despus de filtrar

Retarda sobre oxidacin

 HEMATOXILINA HARRIS
Colorante: Hematoxilina
Hematoxilina Solvente: etanol

Alumbre en agua
Mordiente Calentar hasta ebullicin.
Mezclar

Sacar del calor.

Oxidante Agregar con precaucin Ox. Rojo de
mercurio

Antes de usar, filtrar y agregar cido actico

Acido glacial
 Hematoxilinas Alumnicas:

Hematena + iones Al = HEMALUMBRE.

El Al +3 tiene afinidad por el DNA

Progresivos o regresivos

Diferenciacin se realiza con

soluciones cidas
 Azulamiento

pH cidos Hemalumbre rojizo

Lavados en Azulamiento lento

agua
corriente pH agua corriente?

Soluciones Agua carbonatada

alcalinas Borax
 H. Frricas
Alumbre de fierro.
Ms resistentes a soluciones cidas.
Progresivas o regresivas
 CARMIN
Colorante natural Cochinillas hembras
Molcula compleja
Tie como carmalumbre las mismas
estructuras que las lacas de hematena.
Carmn 1% acuoso en alumbre amoniacal.
Diferenciacin con agua.
Tiempos de tincin 1 a 24 horas.
 FUCSINAS
Uso en coloraciones tricrmicas

Fucsina bsica CI 42510 1% en agua

destilada
 Colorantes Citoplasmaticos
Menos especficos
Principalmente derivados Xantnicos
 Eosina
Colorante cido lo que le permite
enlazarse con constituyentes celulares de
carga positiva:

Citoplasma
Colgeno
Fibras musculares
 Coloracin Eosina

Soluciones acuosas o alcohlicas

Eosinfilos o acidfilos
+++ +++ +++
HISTIDINA LISINA ARGININA

TEJIDO
 XANTENICOS: EOSINA
EOSINA B

EOSINA Y
Clasificacin

Ortocromticos

Metacromticos
 Clasificacin
Colorantes Carga global aninicos.
cidos
Colorantes Carga global catinica. +
bsicos
Colorantes No son bsicos ni cidos, colorean por un
mecanismo diferente. Ej. Impregnaciones
indiferentes
Colorantes Mezcla de colorantes cidos y bsicos con
carga neutra. Ej Giemsa
Neutros
 Color Index

Eosin Y (yellowish eosin): acid red 87, bromoacid J,

bromoacid S, bromoacid siguientes nombres alternativos:
Rojo cido 87, bromocido J, bromocido S, bromocido

CI: nmero nico. Sociedad de Tintereros y coloristas

Siempre incluir el CI ej. Eosina Y CI 45380

 Bibliografa
1. Theory and practice of Histological Techniques.
Bancroft 2008
2. Tcnicas en histologa y biologa celular Luis
Montuenga Badia
3. Manual de Laboratorio Clnico Diagnstico Raimundo
Garca del Moral 2000
4. Histological and Histochemical Methods Theory and
Practice Kiernan 4 edicin
5. Histotechnology A Self- Instructional Text Carson 3
edicin