TCNICAS DE PREPARACIN DE

MUESTRAS PARA
OBSERVARLAS AL
MICROSCOPIO
 ANTES DEBEMOS CONSIDERAR QUE
Al observar una estructura al microscopio ptico o
electrnico, la luz o los electrones atraviesas la muestra
dando lugar a la formacin de imgenes.
En el caso de la microscopa ptica la muestras deben
tener un grosor de 5-8 micrmetros
En el caso de la microscopa electrnica, entre 20y 40
nanmetros.
 PREPARACIN DEL MATERIAL BIOLGICO
MUERTO
FIJACIN: se logra detener los procesos de destruccin, celular o hstica, debida
a las enzimas contenidas en ellos. una vez muerto el organismo o al separarla
de l.
Adems la sustancia se conserva lo ms natural posible, ya que las sustancias
fijadoras acusan sobre los componentes celulares deteniendo la autolisis
mediante reacciones qumicas con reactivos como el formol, el grutaraldehido, el
tetraxido de osmio, etc pueden continuar coagulando las protenas cuando se
utiliza calor.

Autolisis: Proceso biolgico por el cual una clula se autodestruye, ya sea porque no es ms necesaria o porque est
daada y debe prevenirse un dao mayor.
 INCLUSIN DEL TEJIDO
Para que el material tenga la suficiente firmeza al cortarse.
El agua que contiene el tejido se sustituya por una sustancia que la de rigidez y evita que se
deforme.
Esto se logra al introducir el material en alcoholes de graduacin creciente, esto sustituye al
agua por alcohol.
Despus el alcohol es sustituido por un solvente orgnico como es el xilol, la acetona, etc. para
de esta forma terminar incluyendo el tejido en una sustancia que es miscible en este solvente
orgnico.
DICHAS SUSTANCIAS SON:
PARAFINA EN MICROSCOPA PTICA
RESINAS SINTTICAS EN MICROSCOPA ELECTRNICA
 EL CORTE Y LA TINCIN
Se realiza con equipos especiales, los cuales presentan cuchillas que corta lascas del material.
En microscopa ptica se utilizan cuchillas de acero y el equipo recibe el nombre de micrtomo. Los
cortes para su observacin se montan en un lmina de vidrio llamada portaobjetos.
En microscopa electrnica se utilizan los ultramicrtomos, que emplean cuchillas de vidrio o
diamante. Los cortes para su observacin se montan en unas rejillas metlicas pequeas con
perforaciones, que permiten el paso del haz electrnico.

La posibilidad de observar una tincin dada en una estructura se debe a que esta se comporta como
un filtro de color, DEJANDO PASAR SOLAMENTE LA LUZ DE DETERMINARA LONGITUD DE ONDA.
Y LA COLORACIN?
Los colorantes comnmente usados para la observacin de lminas histolgicas, son sales
neutras que presentan radicales cidos o bsicos , es decir, colorantes cidos y bsicos.
Una coloracin de uso corriente en histologa es la hematoxilina y eosina (h / e) que emplea
ambos tipos de colorantes. con esta coloracin se observa el ncleo que se tie con el
colorante bsico (azul), y el citoplasma con el colorante cido (rosado).
Las tcnicas de tincin incluyen tambin la utilizacin de varios colorantes.
 TCNICA DE CONGELACIN FACTURA
Mediante este tcnica es posible estudiar el M/E estructuras celulares superficiales o puestas
al descubierto por medio de la fractura de una muestra congelada a muy bajas temperaturas,
sin ningn tipo de procesamiento qumico que altere la ultraestructura de la misma.
L a muestra se congela en nitrgeno lquido (-196C) y se monta en un equipo donde hay un
dispositivo especial dentro de una campana, en la cual se hace un alto vaco. Mediante una
cuchilla se produce un corte que provoca una lnea de fractura en la muestra, quedando
expuesta la superficie donde se produjo el corte.
Esta superficie pierde agua por sublimacin y posteriormente se le evaporan el carbn y
metales pesados desde diferentes ngulos, hasta cubrirla en su totalidad, logrando de esta
manera, una rplica o mascarilla de la misma. Por un procedimiento donde se elimina el
material biolgico, la rplica se separa de la muestra y se examina, en ella se pueden apreciar
las caractersticas que quedaron de la rplica.
Sublimacin o volatilizacin: Es el proceso que consiste en cambiar el estado slido de una materia al estado gaseoso, sin
pasar por el estado lquido.
 MTODOS CITOQUMICOS
El objetivo de estos mtodos es la localizacin e identificacin de las
sustancias qumicas constituyentes de las clulas, para lo cual hay 2
lneas de investigacin:
Obtencin de fracciones subcelulares y su posterior anlisis
bioqumico
Determinacin de diferentes compuestos qumicos en el interior de
la clula
 TCNICA CITOQUMICA
Las clulas y los tejidos estn constituidas por protenas, carbohidratos y otros
componentes, los cuales se encuentran formando parte de la estructura de los
mismos.
Estassustancias son qumicamente activas, es decir, que en determinadas
condiciones es posible hacerlas reaccionar con otros compuestos.
Dicha reaccin es el principio en que se basan las tcnicas citoqumicas e
histoqumicas para la demostracin, en las clulas y los tejidos, de un compuesto
o sustancia, o para determinar la actividad de una enzima, o complejos
enzimticos celulares hsticos.
 El producto de estas reacciones son compuestos coloreados visibles al microscopio ptico, o de alta
densidad para su visualizacin al microscopio electrnico.
Por ejemplo:
La demostracin de lpidos acumulados intracelularmente en algunas patologas
La demostracin de lpidos que forman las estructuras celulares
Se pueden llevar a cabo mediante diversas tcnicas con substancias que reaccionan con las grasas;
uno de estos es el tetraxido de osmio, que reaccionan con los lpidos no saturados, y da un
compuesto de color negro que puede distinguirse tanto al microscopio ptico como al electrnico
debido a su alta densidad.

En otras ocasiones, es posible, mediante esta tcnica,

Demostrar la presencia o ausencia de un orgnulo celular. las clulas objeto de estudio se ponen en
contacto con sustratos especficos que reaccionarn con los componentes qumicos de un orgnulo
dado, as dando coloracin al m/o.
Estas tcnicas brindan una informacin de la composicin qumica celular, as como de sus
elementos estructurales y su localizacin.
 TCNICA INMUNOCITOQUMICA
Determinadas clulas de organismos superiores tienen la capacidad de responder ante sustancias
extraas, antgenos, sintetizando otros compuestos llamados anticuerpos.
Esta se basa en el reconocimiento del antgeno por un anticuerpo que previamente se conjuga con
un fluorocromo, una enzima o un coloide de un metal pesado (por ejemplo el oro).
Al conjugarse estos compuestos , los anticuerpos pueden reconocer en el tejido o en la clula, los
componentes antignicos contra los cuales fueron desarrollados, poniendo as de manifiesto la
localizacin o presencia de aquellas estructuras objetos del estudio , mediante reacciones
qumicas o a travs de microscopios (microscopios de fluorescencia y electrnico.
Si se emplea un M/Fluorescencia, el marcador ser un fluorocromos, los cuales emiten
fluorescencia al ser excitados por la luz ultravioleta
Si la reaccin antgeno -anticuerpo se evidencia mediante una enzima se hace necesario el empleo
del sustrato de la misma, adems de una sustancia que proporcione un color determinador o un
precipitado que pueda ser distinguido en un microscopio ptico de cambo brillante o con una
tcnica adecuada al microscopio electrnico.