Mtodos hidrodinmicos

Tcnicas que involucran el transporte, movimiento, de

macromolculas biolgicas en un fludo (agua)

Sedimentacin (velocidad y equilibrio)

Electroforesis (nativa y desnaturalizante)
Gel filtracin, SEC
Dispersin de luz, light scattering (clsica y dinmica)

Obtenemos informacin de estructura cuaternaria, peso

molecular, composicin de subunidades, agregados,
forma, grado de solvatacin
 SEDIMENTACIN

Transporte de una partcula en solucin sometida a una fuerza

(gravitacional o centrfuga)

Para sedimentar una partcula slo por accin de la gravedad,

deben ser partculas grandes.
Para separar macromolculas biolgicas en suspensin por
sedimentacin debemos usar fuerza centrfuga
(CENTRIFUGACIN)
Y aceleraciones altas!
Particula en suspensin en medio fludo, en tubo de centrfuga,
contenido en un rotor, que gira alrededor de su eje A a una
velocidad angular , rad/s (=2/60 rpm)

Simplificando, podemos decir que la partcula est

sometida a 3 fuerzas:
Fc =fuerza centrfuga
Fb = fuerza de empuje
Ff = fuerza de fricccin
Fc = m 2 r m = masa partcula
= vel. angular rotor
r = radio rotor

Fb = mo 2 r mo = masa del solvente desplazado

mo = m = densidad del solvente

= volmen especfico parcial

Ff = f v f = coeficiente de friccin
v = velocidad de la partcula

La partcula alcanza una velocidad constante (v) cuando la

fuerza neta es cero: Fc + Fb + Ff = 0
VELOCIDAD DE SEDIMENTACIN (v)

v = 2 r m (1 - )
f

Definimos COEFICIENTE DE SEDIMENTACIN (S):

S= v = m (1 - )
2 r f

Multiplicando por el nmero de Avogadro N: m N = M (peso molecular)

S = M (1 - ) M = peso molecular
Nf (1- ) = factor de empuje
f = coeficiente de friccin
Relacin entre coeficiente de sedimentacin S y coeficiente de difusin D

S = M (1 - )
Nf

D = coeficiente de difusin:
D = k T/f = R T/N f

S = D M (1 - )
Relacin de Svedberg
RT

Determinacin de peso molecular M, en forma absoluta (sin estndares

de peso molecular) pero hay que conocer S o D.

1 Svedberg, 1 S = 10-13 s
Experimento de velocidad de sedimentacin. Solucin de una protena
a determinada concentracin, c, la sometemos a centrifugacin. Se
empieza a mover hacia el fondo del tubo y se genera una zona clara, slo
solvente cerca del menisco y un frente mvil que limita solvente de
solucin

Si seguimos la velocidad con que se mueve ese frente mvil

(en una ultracentrfuga analtica), podemos determinar S,
coeficiente de sedimentacin para esa protena
Determinacin de S

v = dr/dt = 2 r S

Integrando: ln r/ro = 2 S (t to)

El frente de sedimentacin es bien definido al principio pero se va

deformando a medida avanza, por la difusin de las partculas en el
frente. Partculas de alto M, difunden poco y el frente es ms definido.
 Factores que afectan S

Temperatura (S20,w)

Masa
a mayor M > mayor S, para ADN: M
para protenas: M2/3

Forma
S es inversamente proporcional a f
Para partcula esfrica no hidratada: fo = 6 ro

Grado de solvatacin

Concentracin
Con la concentracin f aumenta > S disminuye con la conc.
S = So (dil)/ 1 + k conc.

Carga
 Se agrega a altas conc.

Protena compacta

Molcula extendida

S vara con el coeficiente de friccin, que a su vez depende de la

concentracin de la macromolcula utilizada, ms fuertemente para
molculas extendidas
Relacin entre coeficiente de sedimentacin S y tamao, forma, hidratacin

S = M (1 - )
Nf

f = coeficiente de friccin, depende de tamao, forma, hidratacin de la macromolcula

Relacin entre coeficiente de sedimentacin S y tamao, forma, hidratacin

S = M (1 - )
Nf

f = coeficiente de friccin, depende de tamao, forma, hidratacin de la macromolcula

Para macromolcula esfrica y no hidratada: f = 6 ro
= viscosidad del medio
ro = radio de la partcula, que est relacionado con su pero molecular, M:
Vo = 4/3 ro3 = M /N

= volumen especfico parcial 1/ (partcula) Vo / m Vo N/ M

S = M2/3 (1 - ) x 0.012
1/3
S = M2/3 (1 - ) x 0.012
1/3
A partir de la determinacin de S, puedo inferir algo sobre la forma o el
grado de hidratacin de mi macromolcula en estudio

So = M2/3 (1 - ) x 0.012
1/3

Primero, si conozco el M y asumo forma esfrica, puedo calcular So

Por otro lado determino experimentalmente S, S20,w

Si S20,w > So > oligmero

Si S20, w < So > monmero con forma extendida

A partir de la determinacin de S, puedo inferir algo sobre la forma o el
grado de hidratacin de mi macromolcula en estudio

So = M2/3 (1 - ) x 0.012
1/3

Ejemplo: Protena de 50 kDa, = 0.73 mg/ml > So = 4.93

Por otro lado determino experimentalmente S, S = 5.67 S (PBS, 30C)

> S20,w = 5.87 S

S20,w = 5.87 > So = 4.93 oligmero?

Calculo So para el dmero So = 7.75

Para el dmero: S20,w = 5.87 < So = 7.75

El resultado sugiere se trata de un dmero con forma extendida, f/fo >1

S

Valores de S de varias biomolculas, organelos subcelulares y organismos

 CENTRIFUGACIN
Diferencial (sobrenadante + sedimento pellet)
La idea es sedimentar al fondo del tubo, el componente de mayor S
Se usa para separar una mezcla compleja en los distintos
componentes en base a sus diferencias de tamao y/o masa
Diferencias grandes de S para lograr separacin
En general se realiza en sistema homogneo, pero se puede hacer
a travs de gradiente de densidad

Frente mvil (frente de sedimentacin)

Las partculas se mueven a una velocidad determinada por su S,
pero se detiene la centrifugacin antes de que el componente ms
pesado alcance el fondo del tubo
Para separar partculas que difieren en tamao pero no en densidad
(ej. protenas)
Puede ser en sistema homogneo o en gradiente de densidad
 ULTRACENTRIFUGACIN EN SOLVENTE HOMOGNEO
(SIN GRADIENTE)

1) VELOCIDAD DE SEDIMENTACIN (FRENTE DE SEDIMENTACIN)

Las partculas se mueven a una velocidad determinada por su S, se
separan por diferencia en su tamao
Se forma un frente de sedimentacin
Se usan velocidades altas (> 100.000 g)
Se registra variacin de concentracin a lo largo del tubo (dC vs dr)

2) EQUILIBRIO DE SEDIMENTACIN
Las partculas se separan por diferencia en su densidad
Se deja alcanzar el equilibrio entre sedimentacin y difusin
Se forma un gradiente de concentracin a lo largo del
Se usan velocidades bajas (100 10.000 g)
Se registra variacin de concentracin a lo largo del tubo (dC vs dr)
y se linealiza: lnC vs r2
EQUILIBRIO DE
SEDIMENTACIN
EQUILIBRIO DE
SEDIMENTACIN
 Desventajas de los experimentos velocidad de sedimentacin:

Instrumento caro y especializado: ultracentrfuga analtica

Registro de la concentracin, necesita compuesto que absorba
y concentrado
Dificultad en resolver mezclas
Analtica, no preparativa

ULTRACENTRIFUGACIN ZONAL (SOBRE GRADIENTE DE DENSIDAD)

La solucin de la macromolcula se coloca sobre el gradiente

Se usa alta velocidad
Se forman bandas (zonas) y no un frente de sedimentacin
Mejor separacin (y recuperacin) de los componentes
Se puede hacer preparativa
Partcula Densidad () Gradiente
g/ml

RNA 2 Cs2SO4

DNA 1.7 CsCl

Ribosomas 1.55 CsCl

Protenas 1.3 Glicerol,

sacarosa, Ficoll
Organelos 1 1.3 Sacarosa, Ficoll,
Percol
Lipoprotenas 1 KBr
EQUILIBRIO DE SEDIMENTACIN
en gradiente
CENTRIFUGACIN ISOPCNICA

En ro:
(gradiente) = (particula) = 1/