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Molgramostim (GM-CSF No

Glicosilado)
Maximiliano Mondragn| Enrique Pineda| Anlisis de Medicamentos
Qu es el Molgramostin?
Es un factor estimulante de colonias de
granulocitos y macrfagos (GM-CSF),
constituido por 127 aminocidos y no
glicosilado.
Datos

Compuesto por: 127 aminocidos


Frmula : C639H1007N171O196S8
Peso Molecular: 14 477 Da
Descripcin

Polvo blanco,
Libre de
Liofilizado partculas
extraas

Contiene como
mnimo 2.0 mg Solucin
de Protena/mL
Solucin incolora Libre de
o ligeramente partculas
amarilla extraas
Produccin

Aprobacin:

Protenas del hospedero

ADN residual
Ensayos de Identidad:
Ensayo Especificacin
act. biolgica esperada: 10 x 106
Resultado
Actividad biolgica esperada
A. Potencia (MPB 0340)
UI/mg de protena
B. Enfoque Isoelctrico Barra principal de muestra Las barras corresponden
corresponde con la barra PI:
principal de la referencia. PI no Muestra: 5.0
ms de 0.2 unidades de dif. Referencia 5.1

C. Impurezas con Masa La posicin de las bandas es Posicin de bandas similares


molecular diferente a la del similar: s-ref FEUM y muestra tanto s-ref FEUM como en
molgramostim (MGA 0311). evaluada. muestra evaluada.

D. Mapeo de Pptidos (MGA Corresponde con el Corresponde con el


0241: CLAR) cromatograma de referencia cromatograma de referencia

E. Secuencia N-terminal 16 primeros Aa N-terminal Los 16 primeros Aa N terminal


debern ser Ala-Pro-Ala-Arg-Ser- Ala-Pro-Ala-Arg-Ser-Pro-Ser -
Pro-Ser -Pro-Scr-Thr -GIn-Pro- Pro-Scr-Thr -G In-Pro-Trp-Glu-
Trp-Glu-His-Val His-Val corresponden.

Endotoxinas bacterianas (MGA No ms de 5 UI/mg 3 UI/mg


0316)
Protenas relacionadas (MGA Mximo para cada impureza: Por impureza: 1.01%
0241: CLAR) 1.5%
Mximo, impurezas totales (e 5- Para impurezas totales: 3%
30) : 4%
Ensayo de Identidad

Alternativa 1 Alternativa 2

A A

B B

C C

D D

- E
A. Potencia

MPB 0340. BIOANLISIS EN CLULAS TF-1 DE FACTOR ESTIMULADOR


DE COLONlAS DE GRANULOCITOS Y MACROFAGOS

Fundamento:

Se basa en la estimulacin de la proliferaci6n de celulas TF-I, dnde la sal de


tetrazolio reacciona por la enzima deshidrogenasa mitocondrial para obtener
formazn, el cual se mide espectrofotomtricamente. Comparacin 50 % vs 50
%.
B. Enfoque Isolctrico
C. Electroforesis en Gel de Poliacrilamida-SDS
D. Mapeo de pptidos

Identificacin de una protena, as como el producto final de varios procesos


que proporcionan una comprensin completa de la protena que se analiza.

Divisin selectiva de enlaces


Aislamiento y Purificacin
peptdicos

Separacin cromatogrfica de
Anlisis Validado
pptidos
E. Secuencia N-terminal
Hay que hacer una degradacin de Edman en un equipo secuenciador de fase
solida.
Cargar 1mmol de material a probar en el cartucho del secuenciador
Correr 16 ciclos

El procedimiento de separacin se calibra usando:


Mezcla de a.a-PTH
Una mezcla del primer ciclo de secuenciacin en blanco
MGA 316 Determinacin de Endotoxinas
Bacterianas
Endotoxinas/ Lipopoliscaridos
La tcnica de cuantificacin ocupa el lisado de Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus
Metodo A: Formacion de un gel
Metodo B: Turbidimetrico y cromogenico

Material y reactivos
Control Estndar de Endotoxina (CEE) = preparacin de endotoxina de E. coli caracterizada
Lisado de amebocitos (LAL)
*El material empleado debe estar libre de endotoxinas (material de vidrio y termorresistente ciclos
de 250C x 30min)
Impureza molecular diferente al Molgramostim
Analizar por electroforesis gel poliacrilamida-SDS (14% acrilamida, espesor 0,75mm), en el ensayo se realiza en
condiciones reductoras y no reductoras.
Solucin amortiguadora muestra A: 50% agua, 50% sol concentrada de muestra R
Solucin amortiguadora muestra B: 50% agua, 50% sol concentrada de muestra para condiciones reductoras R
Muestra 1 control muestra + H20 C= 1,0mg/ml + sol. Amortiguadora concentrada de muestra R
Muestra 2 control 2% Diluir 20uL de la muestra 1 con 980 uL de sol. Amortiguadora de muestra A
Muestra 3 control 1% 0,2 mL de la muestra 2 + 0,2mL de sol. Amortiguadora A
Muestra 4 control 0,5% **
Muestra 5 control 0,25% **
Muestra 6 control 0,1 **
Muestra 7 control 0,05 **
Muestra 8 control 0,025 **
Muestra 9 Preparar igual que la muestra 1, pero con sol. Amortiguadora condiciones reductoras
Muestra 10-16 Preparar igual que muestra 2-8 pero con solucin amortiguadora de muestra B
Impureza molecular diferente al Molgramostim
Prep. Ref 1 Diluir ref. molgramostim en agua C= 0,02 mg/ml + Sol. Amortiguadora concentrada muestra R
Prep, Ref 2 ** + Sol. Amortiguadora concentrada para condiciones reductoras de muestra R
Prep. Ref 3 Marcadores de peso molecular 14,400- 94,000 Da
*Calentar las muestras a ebullicin x 3min
Colocar 50uL de muestra en condiciones reductoras o no, en geles separados segn corresponda
Sumergir el gel toda la noche en una mezcla 10:40:50 COOH, H20, MetOh.
Transferir el gel a una sol de 100g/L de glutaraldehido 30min.
Remplazar el glutaraldehido por agua x 20 min.
Transferir el gel a una mezcla 0,75 g/L NaOH, 14 g/L NH4OH y 8 g/L AgNo3.
Colocar en un agitador oscuridad x 5min, Lavar cada 30 seg con agua
Agitar el gel es una mezcla 0,05 g/Lde acido ctrico, formaldehido 0,05% (v/v), MetOh + H20 0,005% (v/v)
Impureza molecular diferente al Molgramostim
*Las bandas de protenas se harn visibles en esta etapa
Comprar la intensidad de cada una de las bandas al Molgramostim, el nivel de impurezas se
estima con la dilucin