Kr.

Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

HPLC = High Performance Liquid Chromatography
High Pressure Liquid Chromatography
Penyederhanaan/modernisasi cara kromatografi klasik
(kertas, lapis tipis, kolom) menjadi suatu alat (instrumen)
dalam tehnik pemisahan komponen kimia
Pemisahan senyawa kimia berdasarkan 2 fasa (fs. mobil & fs. diam)

Keuntungan Kerugian

- Aliran eluen tetap - Sangat mahal

- Analisa cepat - Pelarut harus murni (Lichrosolv)
- Daya pisah tinggi - Kolom harus banyak
- Kolom dapat dipakai kembali - Electric power
- Sampel sedikit
-P.Simanjuntak/TPK
Analisa kualitatif dan kuantitatif 1
 Detektor
kolom
Pompa Injektor
Reservoir

waste

Rekorder

P.Simanjuntak/TPK 2
 Reservoir 1
Alur Kerja fasa gerak
KCKT
Pompa 2

Filter 3
Pressure 4
Gauge
Pemasukan sampel 5
(injektor)

Kolom 6

Rekorder 8a Detektor 7 Data sistem 8b

Pengumpulan fraksi 9
P.Simanjuntak/TPK 3
1. Reservoir pelarut
- Eluen tidak mengandung gas udara. Bila ada gas, aliran
eluen menjadi diskontinyu
[Bagaimana cara untuk menghilangkan gas ?]
- Sistem pelarut (i). Isokratik (satu jenis eluen
(ii). Gradient/landaian (Lebih dari 1 jenis)

2. Pompa
- Untuk mengalirkan eluen sebagai fasa mobil dengan
kecepatan dan tekanan tetap
Gangguan pada pompa :
- Eluen/pelarut yang tidak difiltrasi
- Adanya elektrolit klorida yang tinggi pada pH rendah
yang mengakibatkan terbentuk endapan
- Tekanan pompa tergantung ukuran kolom dan
viskositas eluen
P.Simanjuntak/TPK 4
 - Kolom yang besar mempunyai tekanan tinggi
Kolom {diameter 5 mm. Kecep. alir 1-2 mL/menit
. Tekanan 400 bar}
- Viskositas tinggi, tekanan tinggi (misal ; eluen air)

3. Filter (Penyaring)
- Penyaringan eluen yang mengandung impurities

4. Pressure Gauge
- Stabilisator tekanan pompa

5. Injektor
- Tempat sampel dimasukkan/injeksi
- Injeksi dapat dilakukan melalui septum atau non septum

P.Simanjuntak/TPK 5
6. Kolom
- Kolom merupakan jantung alat kromatografi
kolom dapat dibagi menjadi 2 macam, yaitu :

a. Kolom analitik
kolom yang mempunyai garis tengah dalam 2-6 mm
panjangnya untuk partikel biasa 50-100 cm
untuk mikropartikel 10-30 cm

b. Kolom preparatif
Bergaris tengah 6 mm atau lebih, dengan panjang
25 100 cm
Biasanya terbuat dari baja nirkarat dan dipakai pada
suhu kamar

P.Simanjuntak/TPK 6
7. Detektor
- Detektor digunakan untuk mendeteksi adanya komponen
dalam kolom dan mengukur jumlahnya (bgm ?)
- Detektor yang paling banyak dipakai adalah detektor
UV-Vis (200-270 nm), karena hampir semua komponen
komponen kimia dapat dideteksi pada panj. gel. Ini.

Jenis-jenis detektor lainnya :

- Detektor Fluoresensi
Detektor ini tidak banyak komponen kimia bisa dideteksi
detektor ini sangat peka dan dapat mendeteksi kadar
senyawa kimia yang sangat kecil seperti aflatoksin,
aromatik berinti banyak, vitamin tertentu dan derivat
asam amino
Kelemahan detektor ini (??)
P.Simanjuntak/TPK 7
- Detektor Konduktivitas
Detektor ini bekerja dengan mengukur konduktivitas
eluen dari kolom. Dapat dilakukan dengan cara :
menempatkan dua elektroda yang tidak reaktif (inert)
dalam aliran eluen serta mengukur tahanan antara
keduanya. Sehingga digunakan untuk mengukur
senyawa yang bersifat ionik.

Kelemahan detektor ini adalah:

- Penggunaan bufer harus dihindari, karena
bufer ion mempunyai konduktivitas yang tinggi

P.Simanjuntak/TPK 8
- Detektor Indeks Refraksi (RI Detector)
Detektor ini bekerja atas dasar terjadinya perubahan
nilai indeks refraksi dari suatu cairan yang mengalir
bila di dalamnya terlarut suatu zat kimia

Bila hanya fasa mobil murni yang mengalir, maka yang

akan dihasilkan adalah garis dasar yang lurus.

Kelemahan detektor ini adalah :

- Tidak dapat memakai pelarut gradien
- Detektor ini bisa dipakai untuk analisa gula dan
asam lemak

P.Simanjuntak/TPK 9
- Detektor FID (Flame Ionization Detector)
Banyak senyawa kimia yang larut dalam suatu pelarut
dan terdeteksi secara bersama-sama.
Sehingga detektor ini digunakan untuk menghilangkan
terdeteksinya pelarut.

Caranya :
Eluen dari kolom dialirkan pada permukaan kawat,
kemudian kealat pirolisis dan akhirnya ke FID

Derivatisasi :
Banyak senyawa kimia yang sukar untuk dideteksi dengan
detektor yang ada. Untuk mengatasi hal ini dan untuk
mempermudah pendeteksian maka dilakukan derivatisasi

P.Simanjuntak/TPK 10
Proses derivatisasi dapat dilakukan :
1. Sebelum sampel diinjeksi (pre-column derivatization)
2. Sesudah sampel diinjeksi (post-column derivatization)

1. Pada proses pre-column

Kondisi reaksi tidak mempengaruhi kondisi kromatografi
Hanya senyawa derivat yang dihasilkan mempunyai sifat
kromatografi yang berbeda (misal Rt)

2. Pada proses post-column

Reaksi derivatisasi terjadi setelah proses pemisahan di
kolom, atau pada eluen yang keluar dari kolom.
karena pemisahan telah berlangsung, maka tidak
mempengaruhi kromatogram.
Hanya reaksi harus dapat berlangsung dengan cepat
sebelum sampel mengalir ke dalam detektor
P.Simanjuntak/TPK 11
 Pompa

Injektor
Pencampuran

Kolom

Pompa reagensia
Pencampuran derivatisasi

Detektor

P.Simanjuntak/TPK 12
8a. Rekorder
Alat yang merekam hasil dari detektor yang berupa
kromatogram

8b. Rekorder
Alat yang menyimpan hasil analisis.
Sehingga data dapat dibuka kembali apabila diperlukan

9. Pengumpulan fraksi
Tempat atau wadah yang digunakan untuk menampung
pembuangan pelarut atau
penampungan fraksi-fraksi hasil analisa

P.Simanjuntak/TPK 13
 Bagaimana proses atau mekanisme
yang terjadi pada sutu sistem kromatografi ??

Apakah proses adsorpsi ? atau partisi ?

atau kedua-duanya ?

Sehingga untuk membedakannya, kromatografi dapat

dibedakan atas polaritas dari fasa diam dan faa geraknya,
yaitu :
1. Kromatografi fasa normal (normal phase chr.)
2. Kromatografi fasa bolak-balik (reversed phase chr.)
3. Kromatografi fasa terikat (bonded phase chr.)

P.Simanjuntak/TPK 14
ad 1. Kr. fasa normal

Pada sistem kromatografi ini :

fasa diam, bersifat polar (silika)
fasa gerak, bersifat non-polar (n-heksan, EA, eter)

Sehingga,
senyawa kimia yang bersifat polar akan tertahan lebih
lama di dalam kolom dibandingkan dengan senyawa
kima yang kurang polar atau senyawa kimia yang
tidak polar sama sekali

P.Simanjuntak/TPK 15
 Fasa diam Fasa gerak
sampel
(polar) yang (non-polar)
dianlisis

Si-OH

Si-OH Polar Non-polar C C C C

Si-OH

Sehingga dalam kromatografi fasa normal, urutan elusi atau

senyawaan yang akan terpisah dapat digambarkan sbr. :

P.Simanjuntak/TPK 16
 OH
OH
A (sangat polar)
OH

OH C B A
B (semipolar)
OH

OH C (non-polar)
OH

OH

Keuntungan pemakaian kr. fasa normal ini adalah :

- Harganya lebih murah
- Mudah untuk membersihkan dari fasa geraknya
- Mempunyai kapasitas yang besar untuk pemeriksaan
sampel yang bersifat non polar
P.Simanjuntak/TPK 17
Contoh aplikasinya adalah

Pemisahan senyawa 2-akroanilin dan 3-kloroanilin

SiOH
NH2
SiOH
Cl
SiOH 2-kloroanilin
SiOH

SiOH NH2

SiOH
SiOH 3-kloroanilin
Cl
SiOH

SiOH

P.Simanjuntak/TPK 18
Pengaruh komposisi fasa gerak pada pemisahan senyawa
Kimia di dalam campurannya

1. n-heksan kloroform = 40 : 60
2. n-heksan kloroform = 50 : 50
3. n-heksan kloroform = 60 : 40

n-heksan:CHCl3 n-heksan:CHCl3 n-heksan:CHCl3

(40 : 60) 50 : 50 (60 : 40)
P.Simanjuntak/TPK 19
ad 2. Kr. fasa bolak-balik

Kromatografi fasa bolak-balik merupakan kebalikan dari

Kromatografi fasa normal, yaitu
fasa diam, bersifat non-polar (hidrokarbon)
fasa gerak, bersifat polar (air, alkohol)

Sehingga,
senyawa kimia yang bersifat non-polar akan tertahan
lebih lama di dalam kolom dibandingkan dengan
senyawa kimia semi-polar atau senyawa kimia yang
sangat polar

P.Simanjuntak/TPK 20
 Sampel
Fasadiam
Fasa diam yang Fasa gerak
Fasa gerak
(non
(non polar)
polar) Contoh
dianalisis (polar)
(polar)

SiCH2(CH2)10CH3

SiCH2(CH2)10CH3
H
Non-polar Polar O
H
SiCH2(CH2)10CH3

Sehingga dalam kromatografi fasa bolak-balik, urutan elusi

atau senyawaan yang akan terpisah dapat digambarkan sbr. :

P.Simanjuntak/TPK 21
 CH3

CH3
A
CH3 non-polar
B
CH3 sedang

C
CH3 sangat polar
B C

CH3 A

CH3

Fasa gerak yang sering digunakan di dalam kromatografi

Bolak-balik adalah metanol, asetonitril, air, buffer dll.

P.Simanjuntak/TPK 22
 Contoh aplikasinya :
Pemisahan senyawa fenitoin dan etotoin

SiCH2(CH2)10CH3 C

Polar Fenitoin
SiCH2(CH2)10CH3

SiCH2(CH2)10CH3

SiCH2(CH2)10CH3
CH3CH2 C
Etotoin
Polar
Polar
P.Simanjuntak/TPK 23
 Pengaruh komposisi fasa gerak pada pemisahan senyawa
Kimia di dalam campurannya

1. MeOH : air = 7 : 1
2. MeOH : air = 6 : 4
3. MeOH : air = 1 : 1

1. MeOH - air = 7 : 3 2. MeOH - air = 6 : 4 3. MeOH - air = 1 : 1

P.Simanjuntak/TPK 24
 ad 3. Kr. fasa terikat (bonded phase)
Silika adalah suatu senyawa kimia yang bersifat reaktif,
yang mana gugusnya dapat diikat (bonded) oleh
gugus lain.
gugus yang sering digunakan atau diikatkan pada
silika adalah C-18 dan C-10, fenil aromatik dan gugus
siano.
Pengikatan gugus non-polar pada silika akan mengubah
sifat kimia permukaannya menjadi non-polar

SiOH + Si-R Si-O-Si-R

Misal : R = C-10

P.Simanjuntak/TPK 25
Fasa gerak

Syarat-syarat :
1. Mempunyai kemurnian dan kestabilan yang tinggi
(Lichrosolv, p.a., teknis)
2. Mudah tercampur dengan pelarut lain
(MeOH-air, n-heksan-etilasetat)
3. Mempunyai toksisitas yang rendah
(Benzen x, CHCl3 x, MeOH, air, n-heksan ok)
4. Mempunyai transmisi UV yang rendah
(puncak yang timbul kecil, dan lebih dahulu)
5. Mempunyai viskositas yang rendah
(air tinggi, n-heksan rendah; perhatikan tekanan KCKT)
6. Mempunyai daya larut yang tinggi terhadap sampel
(Bila campuran, harus salah satu dapat larut)

P.Simanjuntak/TPK 26
 Fasa diam

Syarat-syarat :
1. Sesuaikan dengan kapasitas sampel
(Kr. analisis; kromatografi preparatif)
2. Penggunaan sampel
(Fasa normal, fasa bolak-balik )
3. Kecepatan analisis
4. Pemisahan senyawa yang dianalisis

P.Simanjuntak/TPK 27
sistem gradien

Fasa gerak A Fasa gerak B

Pompa A Pompa B

Pencampur
fasa gerak
Programmer
Kolom &
control

Detektor
dll

P.Simanjuntak/TPK 28
 Mode Operasional KCKT
Syarat eluen/pelarut yang digunakan untuk analisis KCKT
Adalah :
1. Pertama sekali sampel yang akan dianalisis harus larut
sempurna dengan eluen yang akan digunakan
[kenapa ??]
2. Eluen yang digunakan harus didegassing lebih dulu
[Why ??]
3. Sampel harus disaring dengan membran filter 0,45 mm
4. Pastikan bahwa alat KCKT tidak ada kebocoran
(Periksa dari reservoir eluen hingga pada pembuangan eluen)
5. Gunakan pre-kolom bila ada [doshite ??]
6. Pastikan eluen yang digunakan apakah sistem isokratik
atau gradien ?)
P.Simanjuntak/TPK 29
Beda kromatogram KCKT pada isokratik dengan gradien

Metanol 40%

Metanol 90%

Gradien : 0 - 10 (metanol 40%)

10 - 20 (metanol 90 %)

P.Simanjuntak/TPK 30
 Pencucian kolom dari KCKT
MeOH-air n-heksan-EA
polar non polar

Cuci secara
MeOH terbalik Etilasetat

CHCl3/CH2Cl2 CHCl3/CH2Cl2

Etil asetat Simpan MeOH

n-heksan MeOH/air
Reverse phase Normal phase
P.Simanjuntak/TPK 31
Perbedaan Kr. Konvensional dengan Kr. Modern

Kr. Konvensional Kr. Modern

(kr. Kolom, elektroforesis) (KCKT, kr. Gas)

- Lambat - Cepat
- Bahan - Bahan kimia sedikit
- Hasil pemisahan kurang jelas - Hasil pemisahan jelas
- .. -
- -

P.Simanjuntak/TPK 32
Kromatogram merupakan grafik atau peak , yaitu
hasil rekaman yang menggambarkan mutu keluarnya
komponen-komponen kimia hasil dari pemisahan kolom

P.Simanjuntak/TPK 33
1. Dari kiri ke kanan meyatakan waktu (dalam menit)

2. Sumbu vertikal menyatakan intensitas komponen

3. Jumlah peak menyatakan jumlah komponen yang terdapat

di dalam sampel yang dianalisa
[5 peak 5 senyawa atau lebih ?? ]

4. Luas peak menyatakan kuantitas tiap komponen

[semakin besar luas peak,
semakin besar kuantitas komponen

P.Simanjuntak/TPK 34
 BENTUK KROMATOGRAM yang dihasilkan
BERKORELASI
dengan PROSES PEMISAHAN di dalam kolom
Parameter-parameter yang perlu diketahui dan dimengerti
untuk kromatografi modern adalah :
A. Faktor Waktu retensi (tR)
B. Faktor Kapsitas (k')
C. Selektivitas
D. Efisiensi
E. Resolusi

A. Waktu retensi (tR)

tR adalah waktu yang diperlukan oleh suatu komponen (solut)
untuk keluar dari kolom diukur dari menit ke-0 hingga
muncul puncak peak
P.Simanjuntak/TPK 35
B. Faktor Kapasitas (k)
Faktor kapasitas (k) merupakan suatu ukuran kekuatan
interaksi suatu komponen dengan fasa diam
tR - t0 nS VS
k ' = = = K
t0 nm Vm

K = Faktor kapasitas
tR = Waktu retensi, yaitu waktu yang diperlukan oleh
komponen yang berinteraksi dengan fasa diam untuk
meninggalkan kolom
t0 = Waktu yang diperlukan oleh komponen yang tidak
berinteraksi dengan fasa diam utk meningggalkan kolom
ns= Jumlah mol suatu senyawa di dalam fasa diam
nm= Jumlah mol suatu senyawa di dalam fasa gerak
K = Koefisien partisi
Vs= Volume fasa diam
P.Simanjuntak/TPK Vm= Volume fasa gerak 36
Faktor kapasitas tinggi, artinya
komponen berinteraksi dengan fasa diam secara kuat
Faktor kapasitas rendah, artinya
komponen berinteraksi dengan safa diam secara lemah

C. Selektivitas ()
Selektivitas (a) adalah ukuran keterpilihan dua
komponen campuran yang dipisahkan

k'2

k'1
k1 dan k2 : Faktor kapasitas komponen pertama dan
komponen kedua
P.Simanjuntak/TPK 37
Bila, = 1;
Senyawa 1 dan senyawa 2 keluar dari kolom
(muncul bersamaan), artinya :
senyawa 1 tidak dapat dipisahkan dengan senyawa 2

Bila, > 1;
Senyawa 1 lebih dahulu ke luar dari kolom daripada
senyawa 2

Semakin besar harga ,

semakin baik pemisahan

P.Simanjuntak/TPK 38
D. Efisiensi
Semakin lebar peak dari suatu kromatogram, maka
pemisahan semakin kurang efisien

Teori plat (N)

Dalam proses kromatografi,

Inga-
terjadi kesetimbangan distribusi di antara
inga
fasa diam ketika solut bergerak melalui kolom

Teori Plat dapat diartikan bahwa

sepanjang kolom terjadi proses ekstraksi sebanyak N kali

Semakin besar harga N,

maka semakin efisien pula pemisahan
P.Simanjuntak/TPK 39
 2 tR2 = Waktu retensi
tR
N= Standar deviasi

Standar deviasi dapat diganti
dengan lebar peak (W),
maka :

16 tR 2 5,55 tR2
N= atau N=
2
W W21/2

P.Simanjuntak/TPK 40
Efisiensi pemisahan dapat juga dinyatakan dalam bentuk HETP
HETP (Height Equivalent to a Theoritical Plate), sebagai :

L
HETP = L = panjang kolom (cm)
N

Semakin kecil harga HETP, semakin efisien

Karena,
Pemisahan terjadi di dalam kolom, maka efisiensi pemisahan
berarti menggambarkan baik atau jeleknya suatu kolom

Pelebaran peak
Efisiensi
band broadening

P.Simanjuntak/TPK 41
E. Resolusi
Resolusi (RS) adalah derajat pemisahan dua (2) komponen
campuran dalam proses kromatografi yang dinyatakan
sebagai :

N -1 k2
R= 1 + k2
4

Dari persamaan ini dinyatakan bahwa

resolusi dipengaruhi oleh 3 faktor yaitu :
1. Efisiensi (N) rata-rata,
2. Selektivitas ()
3. Retensi (k')

P.Simanjuntak/TPK 42
 Semakin besar harga RS, semakin baik pemisahan

Rs = 0,5 : menunjukkan kromatogram 1 peak

(2 peak menumpuk pada rt yang sama)
Rs = 0,75 : menunjukkan kromatogram sudah mulai
memisah
Rs = 1,5 : menunjukkan kromatogram memisah dengan
baik (rt sudah berbeda)

P.Simanjuntak/TPK 43
Contoh soal :

Gambar di atas adalah kromatogram KCKT

(kolom C-18; 25 cm; MeOH 40%; detektor UV)
Pertanyaan :
1. Berapa komponen terdapat dalam campuran ? dan tentukan rt nya ?
2. Hitung harga faktor kapasitas masing-masing peak ?
3. Hitung harga selektivitas dua peak yang berdekatan ?
4. Hitung harga plat teori (N) dan HETP masing-masing peak ?
5. Hitung harga resolusi pemisahan
P.Simanjuntak/TPK 44
 A B
C

Jawab :
1. Ada 3 komponen yang terdapat dalam kromatogram
yaitu komponen A, Rt = 2 menit
komponen B, Rt = 4 menit
komponen C, Rt = 5,5 menit
2. Faktor kapasitas masing-masing peak (k)
tR - t o 2 - 0,5 1,5
k'A = = = = 3,0
to 0,5 0,5
tR - t o 4,0 - 0,5
k'B = = = 7
to 0,5
tR - t o
P.Simanjuntak/TPK
k'C = = 10 45
to
Faktor kapasitas senyawa C > B > A, sehingga
Senyawa C yang mempunyai interaksi yang kuat
dengan fasa diam.
3. Selektivitas dua peak yang berdekatan
k'2
= AB = 7/3 = 2 1/3, > 1
k'1
BC = 10/7 = 1 3/7, > 1
- > 1, maka komponen A, B dan C dapat terpisah
- Senyawa AB lebih dapat terpisah dengan baik dibandingkan
dengan senyawa BC
4. Plat Teori (N)
16 R2 16 x 2
2
64
NA = = 2
= = 256
2 (0,5) 0,25
w
P.Simanjuntak/TPK 46
 16 R2 16 x 4
2
NB = = 2 = 256
w
2 (1)

16 R2 16 x (5,5)
2
NC = = 2 = 121
w2 (2)

HETP = L/N, L = 25 cm

HETP senyawa A = 25/256 = 0,098

HETP senyawa B = 25/256 = 0,098
HETP senyawa C = 25/121 = 0,206

Senyawa A dan B lebih efisien

P.Simanjuntak/TPK 47
 5. Resolusi (Untuk pemisahan sempurna or not)
N -1 k2
RS =
4 1 + k2

(256 + 256) 2,33 - 1 7

RS AB = 2,33 1+7
4
= 4 x 0,57 x 0,875
= 1,995

(256 + 121) 1,43 - 1 10

RS BC = 1,43 1 + 10
4
= 3,432 x 0,3 x 0,909
= 0,9359
Maka, senyawa AB lebih terpisah daripada senyawa BC
P.Simanjuntak/TPK 48
Pelebaran peak (Band broadening)
Hasil analisis kromatografi disebut sebagai kromatogram.
Kromatogram, yang paling baik adalah berbentuk :
- simetris
- runcing dan
- tidak tumpang tindih satu sama lainnya

Kromatogram (good) Kromatogram (no good)

P.Simanjuntak/TPK 49
Faktor-faktor yang menyebabkan terjadinya pelebaran peak
(Band broadening) adalah :
1. Difusi Eddy
2. Difusi longitudinal
3. Transfer massa
4. Pengaruh laju alir terhadap band broadening

1. Difusi Eddy
Mekanisme Difusi Eddy diakibatkan oleh faktor fasa diam, yaitu
Ukuran partikel pengisi kolom yang tidak merata (sebagian
ada yang besar, sedang dan lainnya yang kecil)

Bagaimana untuk mencegah

terjadinya bandbroadening
yang diakibatkan oleh
faktor difusi Eddy ini ?
P.Simanjuntak/TPK 50
 2. Difusi Longitudinal
Molekul solut cenderung untuk berdifusi ke segala arah.
makin lama solut berada dalam kolom, maka
makin besar kecenderungan untuk berdifusi, artinya
kromatogram menjadi melebar (broad)
[Hal ini terjadi pada molekul gas (pada kromatografi gas]

P.Simanjuntak/TPK 51
3. Transfer massa
Molekul solut ada berada dalam fasa gerak
ada berada dalam fasa diam
Apabila,
fasa gerak mengalir cepat, sementara sebagian molekul solut
masih tidak dapat keluar dari fasa diam,
Maka
Ini mengakibatkan terjadinya band broadening

P.Simanjuntak/TPK 52
4. Pengaruh laju alir terhadap band broadening
Van Deemter, menurunkan rumus untuk menggambarkan
bentuk puncak elusi dari kromatogram, yang berguna
pada optimalisasi kinerja kolom.
Ada 3 prinsip yang memberikan kontribusi pada melebarnya
satu puncak peak, yaitu :
1. Efek multipath atau difusi pusaran (difusi Eddy)
sebagai A
2. Difusi molekuler (Difusi Longitudinal) sebagai B
3. Perlawanan pada perpindahan massa (gas dan cairan)
(transfer massa) sebagai C

HETP = A + B/m + C
Dimana; A,B,C adalah konstanta
m adalah kecepatan aliran (atau kecep.
P.Simanjuntak/TPK 53
linier gas) yang melalui kolom.
 Kecepatan linear gas ditentukan dari :
panjang kolom, cm 1
m= =
waktu retensi udara, detik tm
Jika, HETP diplot terhadap m, diperoleh satu hiperbola dengan
HETP minimum. Pada titik minimum tsb kecepatan
aliran (m) optimum, dimana kolom beoperasi secara
efisien. C terdiri dari dari 2 komponen perlawanan
terhadap perpindahan massa, satu berkaitan degan gas
Cg dan satu lagi berkaitan dengan cairan Cl.
HETP = A + B/m + (Cg + Cl) m

P.Simanjuntak/TPK 54
Pengaruh laju alir terhadap HETP dapat dilakukan dengan
memvariasikan laju alir untuk kolom, fasa gerak, dan solut yang sama
dengan persamaan :
H = B/u + CSu + CMu

P.Simanjuntak/TPK 55
 Good Research
memerlukan Instrumen yang mempunyai
Kepastian Kesesuaian dan
Keefektifan Sistem Operasional,
yaitu
1. Uji Kesesuaian Sistem
2. Linearitas
3. Batas Deteksi dan Batas Kuantitas
4. Uji Perolehan Kembali

P.Simanjuntak/TPK 56
Uji Kesesuaian Sistem (UKS)
UKS dilakukan untuk mendapatkan kesesuaian hasil
pengukuran yang dilakukan berulang sebanyak
5 kali, larutan baku dengan konsentrasi sama
sebanyak 1 mL
Kemudian,
Hitung simpangan baku dan koefisien variasi
(Simpangan baku relatif) < 2,0 %
a. Simpangan Baku X = Luas puncak pada tiap pengukuran
X = Luas puncak rata-rata
(x-x)
n = jumlah pengukuran
n-1
b. Simpangan baku relatif SBR = Simpangan baku relatif
SB = Simpangan baku
SBR = SB x 100 % X = Luas puncak rata-rata yang
x
P.Simanjuntak/TPK 57
diperoleh
Liniearitas
Linearitas menunjukkan kemampuan suatu metode untul
memperoleh hasil pengujian yang sebanding dengan
konsentrasi pada rentang konsentrasi tertentu

Uji liniearitas dilakukan dengan membuat

kurva baku dan
kurva kalibrasi

Y = a + bx

P.Simanjuntak/TPK 58
 x2 . x - x. xy n xy - x y
a= 2 2 b=
n x - x n x2 - (x)2

n - xy - x y
r=
2
n x - 2
x
2
n y2 y

dimana :
a = Harga intersep yang menunjukkan faktor kesalahan sistematis
b = Harga slope yang menunjukkan hubungan antara perubahan absis
(variasi perbandingan kadar) dan ordinat (perbandingan luas puncak)
r = Harga koefisien korelasi
y = Luas puncak
x = Konsentrasi

P.Simanjuntak/TPK 59
Batas Deteksi "Limit of Detection"
Batas Kuantitas "Limit of Quality"
Batas Deteksi (Limit of Detection = LOD)
adalah batas kadar terkecil zat yang akan dianalisis
yang masih dapat terdeteksi dan menghasilkan respon
yang bermakna dan dapat dibedakan dari blanko
3,3 3,3 (y - yp) 2
LOD = x Syx = x
b b n-1
Batas Kuantitas (Limit of Quality = LOQ)
adalah kadar terkecil zat yang dianalisis dengan
presisi dan akurasi yang baik

LOQ = 10 x Syx = 10 x
(y - yp) 2
b b n-1
P.Simanjuntak/TPK 60
dimana ;
Syx = Simpangan baku yang didapat dari nilai y
di sekitar garis regresi
b = Slope yang merupakan kemiringan garis regresi
y = area dari hasil percobaan
yp = area yang dimasukkan ke dalam garis regresi
n = jumlah percobaan

P.Simanjuntak/TPK 61
Uji Perolehan Kembali
Perolehan kembali adalah
Kegiatan untuk menilai ketepatan dari metode yang
digunakan. Kegiatan ini dilakukan dengan menambahkan
sejumlah tertentu bahan baku ke dalam sampel

% Perolehan Ct - Cu
Kembali = x 100 %
Cb
Dimana :
Ct = kadar total yang diperoleh setelah penambahan
larutan baku
Cu = kadarsampel tanpa penambahan larutan baku
Cb = kadar larutan baku yang ditambahkan

P.Simanjuntak/TPK 62
Penetapan Kadar
As/Abp x Cbp x V x f
Kadar = (mg/g)
B
dimana :
As = Luas puncak zat uji
Abp = Luas puncak larutan baku
Cbp = Konsentrasi larutan baku (mg/ml)
B = Bobot (g)
V = Volume akhir (ml)
f = Faktor pengenceran
Penetapan kadar dalam sampel dapat diuji ketelitian/presisi
dengan melihat dari nilai SBR dengan rumus :
SB SBR = Simpangan Baku Relatif
SBR = SB = Simpangan Baku
P.Simanjuntak/TPK x 63
X = Kadar rata-rata yang diperoleh
 Uji t Uji t adalah
Kegiatan pengujian metode analisis, dengan
menggunakan uji statistik student untuk
mengetahui apakah ada perbedaan bermakna
dengan nilai sebenarnya atau tidak.
Uji t dilakukan terhadap hasil uji perolehan
n
kembali
xi
i=1 dimana :
x= n xi = konsentrasi pada setiap percobaan (%)
n x = konsentrasi rata-rata (%)
(xi - x)2 x = % perolehan kembali rata-rata
i=1
SB = U = % perolehan kembali teoritis
n-1 n = jumlah pengukuran
(x - U) n SB = Simpangan baku
t= T = uji t
SB
P.Simanjuntak/TPK 64
Jika, thitung < ttabel, maka ;

Ho diterima berarti tidak ada perbedaan bermakna

antara konsentrasi larutan baku yang ditambahkan
dengan larutan baku yang diperoleh kembali

Jika, thitung > ttabel, maka ;

Ho ditolak berarti ada perbedaan bermakna antara

konsentrasi larutan baku yang ditambahkan dengan
larutan baku yang diperoleh kembali

P.Simanjuntak/TPK 65
 Kondisi KCKT
Sampel : standar
Kolom : LichroCART Lichrospher
NH2, 5 mM, 250-4 mm
Pelarut : asetonitril-air = 75 : 25
Kec. alir : 1,5 ml/men.
Detektor : UV 192 nm, 0,08 AUFS,
655A-22 Merck/Hitachi
Instrumen : 655A Merck/Hitach low
pressure ternary gradient

Peak Rt (menit) senyawa konsentrasi (mg)

1 3,89 ramnosa 100
2 4,70 xilosa 100
3 5,92 fruktosa 100
4 7,68 galaktosa 200
5 10,39 sukrosa 300
6 13,57 maltosa 300
7 14,87 laktosa 300
P.Simanjuntak/TPK 66
 Kondisi KCKT
Sampel : standar
Ko;om : LichroCART Lichrospher NH2, 7 mM,
250-4 mm
Pelarut : asetonitril-air = 76 : 24
Kec. alir : 2 ml/men.
Detektor : UV 192 nm,
655A-22 Merck/Hitachi UV detektor
Instrumen : 655A Merck/Hitach low pressure
ternary gradient

Peak Rt (menit) senyawa konsentrasi (mg)

1 3,89 fruktosa 200

2 4,55 glukosa 250
3 6,52 sukrosa 500
4 8,40 maltosa 300
5 9,37 laktosa 350
P.Simanjuntak/TPK 67
 Kondisi KCKT
Sampel : standar
Ko;om : LichroCART Lichrospher NH2, 5 mM,
250-4 mm
Pelarut : asetonitril-air = 86 : 14
Kec. alir : 2,5 ml/men.
Detektor : UV 192 nm, 0,08 AUFS,
655A-22 Merck/Hitachi UV detektor
Instrumen : 655A Merck/Hitach low pressure
ternary gradient

Peak Rt (menit) senyawa konsentrasi (mg)

1 4,08 yagatosa 200
2 4,59 fruktosa 200
3 6,43 galaktosa 200
4 11,85 sukrosa 400
5 14,94 laktulosa 400
6 18,07 laktosa 400

P.Simanjuntak/TPK 68
 D F
A

B C
E

5 10 15 20 25
Gambar di atas adalah kromatogram KCKT
(kolom C-18; 25 cm; MeOH 40%; detektor UV)
Pertanyaan :
1. Berapa komponen terdapat dalam campuran ? dan tentukan rt nya ?
2. Hitung harga faktor kapasitas masing-masing peak ? (3 senyawa ABC)
3. Hitung harga selektivitas dua peak yang berdekatan ? (AB, BC, CD)
4. Hitung harga plat teori (N) dan HETP masing2 peak ? (3 senyawa ABC)
5. Hitung harga resolusi pemisahan (3 senyawa ABC)

P.Simanjuntak/TPK 69