PURIFICACIN DE ENZIMAS

Por que se purifican las enzimas?

Objetivos y estrategias
Reglas bsicas para la seleccin de un
proceso de purificacin
POR QUE SE PURIFICAN LAS ENZIMAS?

- Conocer exactamente la reaccin catalizada

- Mecanismos de catlisis
- Parmetros cinticos

- Regulacin (alosterismo, modificaciones

postraduccionales, etc)
- Estudios estructurales (Rayos X, RMN,
Dicroismo circular ptico)
- Informacin escalado industrial

Estudio aplicaciones (diagnostico,

quimica ambiental, industria, etc)
 OBJETIVOS EN LA PURIFICACIN

1.- MXIMA CANTIDAD POSIBLE

Porcentaje de enzima purificada respecto a la
cantidad original
2.- MXIMA ACTIVIDAD CATALTICA
Enzima en condiciones operativas

3.- MXIMA PUREZA

No contenga otras protenas, esto condiciona el uso
del enzima
 EVALUACIN DE LA PURIFICACIN
ENZIMTICA

GRADO DE PURIFICACIN
Incremento de actividad especfica
respecto a la de partida
RENDIMIENTO
Porcentaje de enzima purificada

Parmetros que se evalan en la

purificacin
Concentracin de protenas
Actividad enzimtica
 UNIDADES DE ACTIVIDAD ENZIMTICA

Unidad internacional de actividad enzimtica se

define Como la cantidad de enzima que cataliza la
transformacin de 1 micromol de sustrato por
minuto en condiciones estndar
Katal, cantidad de enzima que
consume un mol de sustrato por
Segundo
1 kcat = 60 106 UI
ACTIVIDAD ESPECFICA
Es el resultado de dividir la actividad en
UI por la cantidad de protena presente
en la fraccin Pureza
 REGLAS BSICAS PARA LA SELECCIN DE
UN PROCESO DE PURIFICACIN

1.Elige procesos de separacin basados en las

diferentes propiedades fisico-qumicas

2.Elige condiciones que exploten las mayores

diferencias posibles entre las propiedades de
la enzima a purificar y las protenas
contaminantes
3. En el primer Paso separa las mayor parte
de las protenas contaminantes
4. Usa un paso muy selectivo tan pronto Como sea posible

5. El ultimo paso se reserva para la tecnologa mas

costosa
 Purificacin es un procedimiento secuencial
Preparacin

Fuente Tcnica de
separacin
Repetir con otra
Separacin tecnica de separacin

No
Ensayo de la cantidad de protenas
Ensayo de la actividad enzimtica

No SI Combinar Pura?
Desechar Control de
Fracciones
Hay actividad? pureza

SI

Estudios enzimticos/estructurales, etc

 TAMAO

Dilisis (membranas semipermeables)

 TAMAO
Ultrafiltracion

Centrifugacin en gradiente de densidad

Gradientes continuos de sacarosa tubo de
centrifuga
Los componentes de la mezcla se separan por:
Peso
Tamao
Densidad
Forma
 TAMAO

Cromatografa de filtracin
Las columnas rellenas polimeros inertes

Sephadex: polimeros de dextrano

Sepharose: agarosa
Superose: agarosa entrecruzada
Sephacryl: dextrano-bisacrilamida
Superdex: agarosa y dextrano
 SOLUBILIDAD
Muy utilizados en los primeros pasos de la purificacin
Mantiene nativa a la proteina
Redisolucion sin perdida de actividad

Proteina composicion de aa le otorga un

comportamiento
La solubilidad de la protena depende:
Interaccin intraproteina
Interaccon protena-protena
Interaccin protena- disolvente
 Solubilidad
Interacciones mencionadas dependen
de:
pH
Fuerza inica
Disolvente
Temperatura
 TCNICAS DE PURIFICACIN

Diseo de enzimas:

La fusion de un gen de inters a secuencias

promotoras eficientes hace que una protena se
sobreexprese.

Dirigir la protena sintetizada de novo al periplasma de

la clula.

Adicin de colas de afinidad.