Medicin del crecimiento bacteriano

Dr. Ricardo J. Anselmo

2017
1. Determinacin del nmero de microorganismos
1.1. Mtodos directos: recuento total

1.1.1. Recuento microscpico directo (cmara de

Petroff-Hausser, cmara de Neubauer o hemacitmetro y
mtodo de Breed)

1.1.2. Contadores electrnicos de particular Coulter

1.2. Mtodos indirectos: recuento de viables

1.2.1. Recuento en placa:

1.2.1.1. Por vertido en placa o siembra en

profundidad
 1.2.1.2. Por extensin en superficie

1.2.1.3. Con ansa calibrada

1.2.1.4. Por siembra de gotas en superficie

1.2.2. Filtracin por membrana

1.2.3. Nmero ms probable o tcnica de dilucin en

tubo

2. Determinacin de la masa celular:

2.1. Mtodos directos:

2.1.1. Medida de la masa

 2.1.2. Medida del volumen

2.2. Mtodos indirectos:

2.2.1. Determinacin del contenido de N, C, P, etc.

2.2.2. Turbidimetra
3. Determinacin de la actividad celular:

3.1. Actividad enzimtica

3.2. Concentracin de un metabolito

3.3. Medida de la respiracin

Leer de la gua terica:
recuento total de microorganismos

Leer de la gua prctica:

el tp 5: recuento de microorganismos
viables
 Mtodos indirectos:

recuento de microorganismos viables

 Para entrar en el tema:

Alcuotas o inculos Cantidad de muestra Equivalente

inoculada

100 g o ml 100 102

10 g o ml 10 101
10 ml de 10-1 1 100
1 ml de 10-1 0.1 10-1
1 ml de 10-2 0.01 10-2
1 ml de 10-3 0.001 10-3
1 ml de 10-4 0.0001 10-4
1 ml de 10-5 0.00001 10-5
1 ml de 10-6 0.000001 10-6
Cmo se procede para hacer las diluciones?

Realizar solamente las diluciones suficientes y

necesarias para la obtencin de resultados
fidelignos.

Para evitar:
- Riesgo de contaminacin
- Gasto de material excesivo
 Diluyentes:
NaCl al 0,85 %
Agua peptonada al 0,1 %
Solucin Ringer al
Volmenes:
90 ml (para el homogenato)
225 ml (para el homogenato)
450 ml (para el homogenato)
9 ml (para diluciones subsiguientes decimales)
9,9 ml (para diluciones subsiguientes centecimales)
 Homogenato o primera dilucin (1/10)

Una parte por peso en 9 partes de diluyente.

Ej.: Si la muestra pesa 4 g,
4 X 9 = 36
Entonces, sera 4/40
Esto depende de la muestra, en leche cruda basta
con 1 ml en cambio en leche pasteurizada mnimo
10 ml., en leche esterilizada > cantidad

DEBE SER REPRESENTATIVA DE LA MUESTRA O DEL

LOTE ANALIZADO
 Diluciones subsiguientes:
Decimales y/o centecimales en tubos con 9 9.9
ml de diluyente 90 y/o 99 ml dependiendo
de la cantidad de inoculaciones que deber
efectuar.
 Metodologa estndar
Una placa para que sirva para recuento debe
contener de 30 a 300 unidades formadoras de
colonias (u.f.c.) o colonias contadas (c.c.)/g o ml.

Por qu u.f.c. o c.c.?

 Lmite entre plaqueo y NMP
Muestras lquidas:

10 ml dividido en 5 placas (+ 2 ml en c/u)

2 ml

= 30 colonias/10 ml = 3 colonias/ml
 Lmite entre plaqueo y NMP
Muestras slidas:
10 ml del homogenato o dilucin 1/10 (= 1 g )
dividido en 5 placas (+ 2 ml en c/u)

2 ml

= 30 colonias/g
Filtracin por membrana de 0,2 m

Siempre y cuando la muestra sea filtrable por ej.

Agua potable, siendo inadecuado para leche,
aguas superficiales, etc.

Segn estndares internacionales: Un rango

aceptable de colonias por filtro de membrana es
de 20 a 200.
Filtracin

La membrana de celulosa
retiene a los
microorganismos en su
malla con poros de 0.20-
0.45m. Esta membrana
se transfiere a un medio
de cultivo para el
desarrollo de colonias.
 Nmero Ms Probable
Tambin llamada tcnica de dilucin en tubo,
proporciona una estimacin estadstica de la
densidad microbiana presente en la muestra.
Se basa en que la probabilidad de obtener
tubos con crecimiento positivo disminuye
conforme es menor el volumen de muestra
inoculado.
 Caldo MacConkey
2X 1X 1X
10 ml 1 ml 0,1 ml
de muestra
 Nmero Ms Probable
(< 30 microorganismos/g o < 3 microorganismos/ml)
Interpretacin de la tabla de la gua terico-prctica

N clave: son tres dgitos. El 1 corresponde al ltimo lugar en que todos los
tubos de la serie dieron positivo ms los 2 inmediatamente inferiores.

Por lo tanto, si la tabla utilizada es de series de 3 tubos, el primer dgito debera

ser un 3.

Si la tabla corresponde a series de 5 tubos, el primer dgito debera ser un 5.

Qu haran si se obtiene positividad en todas las series de tubos?

Y si se obtienen resultados negativos en todas las series de tubos?

 TABLA NMP DE 3 TUBOS
N de Tubos Positivos en
Primera serie Serie intermedia ltima serie
0 0
0 0
0 0
0 0
0 1
0 1
0 1
0 1
0 2
0 2
0 2
0 2
0 3
Etc. Etc.
3 3
3 3
NMP en el inculo
de la serie
intermedia de
tubos
0 < 0.03
1 0.03
2 0.06
3 0.09
0 0.03
1 0.061
2 0.092
3 0.12
0 0.062
1 0.093
2 0.12
3 0.16
0 0.094
Etc. Etc.
2 11
3 > 24
Para determinar el NMP/g o ml de muestra se aplica la
siguiente frmula:
NMP/g o ml = Valor NMP de la tabla / cantidad de muestra inoculada en
la serie intermedia

Ejemplo:

100 ml de 10 ml de 1 ml de 0,1 ml de
10-1 10-1 10-1 10-1
= 10 g o ml = 1 g o ml = 0,1 g o ml = 0,01 g o ml
3 3 2 0

0. 93 / 0,1 = 9,3 NMP /g o ml

 Ej.: leche fluida
100 ml 10 ml 1 ml 10-1 ml 10-2 ml 10-3 ml 10-4 ml
3 3 3 3 3 2 0

NMP/ml = Valor NMP de la tabla / cantidad de muestra inoculada en

la serie intermedia

0.93 / 0,001 = 930 NMP/ ml

Cmo procederan para inocular las ltimas tres series de tubos?

 Ej.: suelo agrcola
100 ml 10 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
10-1 10-1 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
10 g 1g 0,1 g 0,01 g 0,001 g 0,0001 g 0,00001 g
3 3 3 3 3 2 0

NMP/g = Valor NMP de la tabla / cantidad de muestra inoculada en la

serie intermedia

0.93 / 0,0001 = 9300 NMP/ g

Nmero Ms Probable de grupos funcionales del suelo por

ejemplo fijadores asimbiticos de Nitrgeno, Nitritadores,
Nitratadores, etc.
Recuento por extensin en superficie (a) y por vertido en
placa o siembra en profundidad (b)
0,1 ml
(a)

1 ml

(b)
Alternativas de clculo de ufc/g o ml:
1. ufc/g o ml = N / vol x dil
donde:
ufc: unidades formadoras de colonias
N: nmero promedio de colonias obtenidas
para una dilucin dada
vol: volumen de inculo
dil: dilucin
2. Dividir N por la cantidad de muestra inoculada,
independiente del mtodo de plaqueo utilizado
es decir superficie o profundidad
 Despus de incubar (dependiendo del grupo de
microorganismos a determinar)

Psicrfilos (a 4C)
Mesfilos (a 30 35C)
Termfilos (a 55C)
Termodricos (60C, 30 min)
Esporas bacterianas aerobias (80C, 10 min
e incubacin aerobia)
Esporas bacterianas anaerobias (80C, 10
min e incubacin anaerobia)
 Expresin de resultados:

UFC o CC/g o ml = a x 10b

a = vara entre 0,1 a 0,9 o menos de 0,1 si los recuentos

muy bajos lo exigieran

b = 2 ms de 2

Ej. 0,2 x 104

 Notacin cientfica:

46.700 = 4.67 X 10.000 = 4.7 X 104

4.000.000 = 4.0 X 1.000.000 = 4.0 X 106

253.000 = 2.53 X 100.000 = 2.5 X 105

1.000 = 1.0 X 1.000 = 1.0 X 103

1 = 1.0 X 100
 Resumiendo
> 30/g o > 3/ml realizo plaqueo.
= 30/g o = 3/ml plaqueo en 5 placas 2 ml de la
muestra lquida o del homogenato de la
muestra slida (total = 10 ml de la muestra
lquida 1.0 g de la muestra slida).
< 30/g o < 3/ml puedo realizar NMP o
filtracin por membrana (si lo permite la
muestra, es decir si es filtrable por ej. Agua
potable)
Realizar esquema de diluciones y cul
o cules deber sembrar para:
a. 1,5 x 106 ufc/g (siembra en superficie)
b. 3,8 x 108 ufc/ml (siembra en profundidad)
c. 8,4 x 105 ufc/g (siembra en superficie)
d. 1,0 x 104 ufc/ml (siembra en profundidad)
e. 2,8 x 107 ufc/g (siembra en superficie)
f. 9,2 x 105 ufc/ml (siembra en profundidad)