2da.

REUNIN TERICA:
Mtodos de estudio de los microorganismos.
Microscopa, medios de cultivo, Control de los
microorganismos por agentes fsicos y qumicos.
Esterilizacin.
Fisiologa Bacteriana. Reproduccin y crecimiento
bacteriano. Curva de crecimiento bacteriano. Medicin
del crecimiento.
2da REUNIN PRCTICA:
Microscopa: Uso del microscopio. Coloracin Gram,
observacin de esporas, cpsula.
Preparacin de medios de cultivo, siembra y aislamiento.
 MTODOS DE ESTUDIO
DE LOS MICROORGANISMOS

Pedro Arnaldo Alvarado Salinas

EL MICROSCOPIO Y MICROSCOPIA
 EL MICROSCOPIO
- El microscopio se origin cuando el hombre aprendi a pulir
lentes con trozos de vidrio y a combinarlas para conseguir
ampliaciones lo bastante grandes que le permitieron ver los
microbios.
- Roger Bacon (siglo XIII). Seres invisibles causaban enfermedad.
- Fracastori de Verona (1483-1553). Y Von Plenciz (1792).
- Kircher (1658). Gusanos invisibles para el ojo humano.
- Robert Hooke (1665). Padre de la teora celular, vio y describi
las clulas de un trozo de corcho.
- Anton van Leeuwenhoek (1632-1723). Fue el primero que
expuso sus observaciones con descripciones y dibujos exactos.
Durante su vida hizo ms de 250 microscopios, el ms potente
no aumentara ms de 200 a 300 veces.
- En la actualidad, con el microscopio se consigue ampliar un
objeto desde unos cientos a cientos de miles de veces.
CLASES DE MICROSCOPIO:

- Existen dos clases de microscopios, segn el principio en que se

funda la amplificacin de la imagen:
A) Microscopios de luz (pticos). Son microscopios que utilizan
un sistema de lentes pticos.
- Campo claro.
- Campo oscuro.
- Ultravioleta.
- Fluorescencia.
- Contraste de fases.
B) Microscopio electrnico. Emplea un haz de electrones, en vez
de ondas luminosas, para obtener la amplificacin de la
imagen.
 ASPECTOS FUNDAMENTALES DEL MICROSCOPIO
Partes del microscopio ptico:
 Longitud de onda
- Se admite generalmente que la luz se propaga por movimientos
ondulatorios, que parten de los cuerpos luminosos, que llegan
as al ojo.
- Las ondas luminosas se propagan a la velocidad de 300,000
kilmetros por segundo.
- Las ondas de luz visible se hallan comprendidas en la zona de
4000 a 7000 A (400 a 700 nanmetros).
- La luz verde, a la que es ms sensible
el ojo humano, tiene una longitud de onda de 500 nm.
 Apertura numrica
- La apertura numrica es igual al producto del ndice de
refraccin del medio (n) entre la lente frontal del objetivo y el
objeto de observacin multiplicado, por el seno de la mitad del
ngulo (sen ) formado por los rayos luminosos que penetran
en la lente frontal desde un punto del objeto.
- Por lo tanto:
 Poder de resolucin.
- Por qu no es posible idear un microscopio ptico con mucho mayor
poder de amplificacin? La limitacin fundamental no es cuestin de
amplificacin, sino de PODER DE RESOLUCIN (PR), o sea la
propiedad de distinguir dos puntos adyacentes claramente separados.
- El poder de resolucin de un microscopio est determinado por
la longitud de onda de la luz y por una cualidad de la lente
objetivo que se conoce como APERTURA NUMRICA (AN).
- Por lo tanto:
longitud de onda de la luz
PR = -----------------------------------
2 x apertura numrica (AN)
500 nm
Ej. PR = ------------- = 200 nm = 0.2 m
2 x 1.25
DISTANCIA FOCAL:
Es la relacin existente entre la longitud del tubo del microscopio
empleado y la amplificacin usada en un momento dado.
longitud del tubo
DF = -----------------------
amplificacin
DISTANCIA DE TRABAJO:
Espacio existente entre el punto ms bajo del objetivo y el objeto
enfocado.
LIMITE DE RESOLUCION:
- Distancia ms pequea por la cual dos objetos pueden estar
separados y ser todava distinguibles como dos objetos separados.
- Depende de la Apertura Numrica y de la longitud de onda de la luz.
- Se puede reducir el lmite de resolucin: disminuyendo la longitud
de onda de la luz y aumentando la apertura numrica.
Profundidad de campo: rea de campo:
Espesor De la preparacin Dimetro de la parte de
enfocada en Cualquier preparacin que se est viendo
Momento (Mayor a Pequeos al microscopio.
aumentos).
Microscopio: a) disposicin esquemtica. b) formacin de la
imagen
Construccin de imgenes
Cuando se forma la imagen en el foco, la luz emergente del ocular, en forma de
rayos paralelos, forma una imagen invertida en el infinito. La lente del ocular
agranda esta imagen y vuelve a invertirla, con lo que percibimos la imagen en su
posicin normal, pero aumentada.
Diagrama simple de la ptica de un microscopio.
OBJETIVO:
VER CON GRAN AUMENTO UN OBJETO
PEQUEO SITUADO A CORTA DISTANCIA

1LENTE OBJETIVO
S LIGERAMENTE
SUPERIOR A LA
DISTANCIA FOCAL IMAGEN
DEL OBJETIVO
REAL
INVERTIDA
AUMENTANDA

f f O
f f fOC O fOC

CON RESPECTO A LA
SEGUNDA LENTE
IMAGEN
CON RESPECTO AL OBJETO VIRTUAL
INICIAL
DERECHA
IMAGEN REAL
AUMENTANDA
INVERTIDA
MAYOR DOBLE AUMENTO
 Microscopia en campo claro
- En la microscopa en campo claro, el campo microscpico, o
zona de observacin, est intensamente iluminado, mientras
que los objetos observados aparecen oscuros.
- En general, los microscopios de este tipo dan una
amplificacin de mil veces, aproximadamente.
- Con ciertas modificaciones, como oculares ms potentes,
esta amplificacin puede hacerse dos o tres veces mayor, que
es el lmite del aumento til que puede alcanzarse.
Microscopa en campo oscuro
- En la microscopa en campo oscuro se realiza la observacin
sobre fondo negro, en el que se destacan los objetos
brillantemente iluminados.
- Un condensador especial dirige el paso del haz luminoso.
- Si el medio que se observa contiene objetos con ndice de
refraccin diferente al suyo, se origina sobre ellos dispersin de
la luz por reflexin y refraccin, y esta luz dispersada penetra
en el objetivo, hace que aparezcan dichos objetos iluminados
en el campo oscuro del microscopio.
Microscopa ultravioleta
- La microscopa ultravioleta permite una resolucin algo mejor y, por
consiguiente, mayor amplificacin que la que se obtiene con el
microscopio ptico corriente.
- La razn de esto es que la radiacin ultravioleta tiene menor longitud
de onda que la luz visible (180 a 400 nm frente a 400 a 700 nm). El
empleo de rayos uv duplica, aproximadamente, el poder que se obtiene
con el microscopio de campo claro.
- La luz ultravioleta es invisible para el ojo humano, no puede ser
captada por la retina y adems es muy nociva; es por ello que la imagen
no se observa directamente, por el contrario debe visualizarse mediante
fluorescencia, fotografa o un sensor
digital. Todos los elementos pticos
del microscopio, incluyendo las
lminas porta y cubre-objetos
estn hechos de cuarzo o fluorita;
no pueden ser de vidrio puesto
que este material no transmite la
luz ultravioleta.
Microscopa de fluorescencia
- Algunos compuestos qumicos absorben la energa de las ondas
ultravioleta y la emiten como ondas visibles de mayor longitud.
Uno de estos cuerpos puede aparecer de un color a la luz
ordinaria y de color completamente diferente a la luz ultravioleta.
Dichos compuestos se llaman fluorescentes, y el fenmeno
fluorescencia.
- Cuando se trata una mezcla de bacterias con una solucin de un
colorante fluorescente, los organismos que retienen en cualquier
forma este producto se hacen fluorescentes, y pueden verse en un
campo microscpico iluminado con luz ultravioleta.
- Fluorocromos: Fluorescena (494 520), Rodamina (540 570).
Microscopa de contraste de fases
- Es muy valiosa para el estudio de las clulas vivas, y ha adquirido
mucha aplicacin en los estudios biolgicos.
- Emplea iluminacin regulada de la preparacin, lo que se realiza
por un sistema objetivo de contraste de fase especial y un
condensador de fase e intensa iluminacin.
- La luz, al pasar de un medio a otro de densidad ligeramente
diferente, experimenta una desviacin, o refraccin, de su
direccin primitiva.
- Al pasar por un medio ptico la longitud de onda de la luz sufre
una disminucin mtrica quedndose igual el nmero de
vibraciones.
- Despus de abandonar el medio, el estado principal es
restablecido, pero un desplazamiento de fase frente a una onda
de luz independiente ha ocurrido.
- Con el sistema de iluminacin controlada es posible distinguir
detalles estructurales que varan poqusimo en espesor o en
ndice de refraccin.
- El conjunto ptico de contraste de fases transforma las
desviaciones de las ondas incidentes en las correspondientes
variaciones de luminosidad.
Microscopa electrnica
- El microscopio electrnico tiene la ventaja de su enorme
amplificacin, porque , a causa de la pequesima longitud de
onda del haz de electrones que se utiliza para amplificar el
objeto, puede aumentarse 100 veces el poder de resolucin del
microscopio ptico.
- El microscopio electrnico emplea ondas de electrones y
campos magnticos para producir la imagen, mientras que el
microscopio ptico utiliza ondas luminosas y lentes.
- En la microscopa electrnica, el material de observacin se
dispone en extensin sumamente fina y seca, sobre pequeas
pantallas que se introducen en el aparato en un punto situado
entre el condensador magntico y el objetivo magntico, que
representa la platina del microscopio ptico.
- La imagen se observa en una pantalla fluorescente a travs de
una mirilla de cierre hermtico, o se impresiona en una placa
fotogrfica por una cmara adaptada al aparato.
Microscopio electrnico de transmisin
- Emite haz de electrones hacia el objeto cuya imagen se desea
aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos
por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen
aumentada de la muestra.
- La muestra se debe cortar en capas finas.
Microscopio electrnico de barrido
- La muestra es recubierta con una capa de metal delgada, y es barrida
con electrones enviados desde un can. Un detector mide la
cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de
muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones,
proyectados en imagen de TV .
- Permite obtener imgenes de gran resolucin en materiales ptreos,
metlicos y orgnicos. La luz se sustituye por un haz de electrones, las
lentes por electroimanes y las muestras se hacen conductoras
metalizando su superficie.
1.Carcasa 2. emisor de electrones 3. electrones 4. ctodo 5. nodo
6. Lente condensador 7. muestra analizada 8. lente objetivo 9. lente
proyector 10. detector (sensor o pelcula fotogrfica).
 TINCIN DE GRAM
Mtodo.
Extensin: En un porta a) 1 minuto en cristal violeta de
objeto limpio (con alcohol,
papel de filtro y flameado)
se coloca una gota de agua
destilada a la que, con el
asa de siembra,
previamente esterilizada a
la llama, se lleva una
pequea cantidad de
suspensin de bacterias o,
en su caso, de una colonia.
Con el asa se extiende la
gota y las bacterias sobre
el porta objeto y se fija la
extensin por el calor,
calentando suavemente a
la llama del mechero hasta
que se seque.
Coloracin:
Hucker (colorante inicial)
b) se lava con agua destilada
c) 1 minuto en lugol (mordiente)
d) se decolora con alcohol de 95
(decolorante)
e) se lava con agua destilada
f) 1 minuto en safranina
(colorante de contraste)
g) se lava con agua corriente
h) se seca suavemente y sin frotar
i) Una vez que la preparacin
est totalmente seca, poner una
gota muy pequea de aceite de
cedro y observar al microscopio
con el objetivo de inmersin.
CULTIVO DE MICROORGANISMOS
CULTIVO medio para producir la proliferacin artificial de
determinados microorganismos.

Nutrientes

Medio
de
cultivo pH

Humedad

O2
MEDIOS DE CULTIVO: HISTORIA

Koch (Rodajas
de patata)

Lister (1878) Walter Hesse

Cultivo puro (1882) Agar-Agar
por diluciones (algas rojas)
seriadas

Brefeld (esporas Petri (1887)

de mohos) Bandejas de
Gelatina vidrio
 Medios selectivos y de
Beijerinck y enriquecimiento
Winogradsky Quimioauttrofas

Medios diferenciales
Wurtz (1892) Indicadores de pH
 TECNICA DE SIEMBRA POR ESTRIAS

Con un asa bacteriolgica, se pasa una

porcin de la muestra a la superficie de un
medio de cultivo hecho a base de agar y se
siembra en el medio por estras en
cuadrantes.
Tipo de Microorganismo

Estado fisiolgico de los microorganismos

Medio ambiente
 AGENTES FSICOS

Temperatura (calor y fro)

Desecacin
Radiacin ionizante y no ionizante
PROCEDIMIENTOS DE ESTERILIZACION/DESINFECCION

Procesos fsicos:
Temperaturas altas:
Calor seco: horno
Calor hmedo: autoclave
Pasterizacin
Ebullicin
Tindalizacin
Temperaturas bajas
Radiaciones:
Ionizantes
No ionizantes
Microondas
Filtracin
AGENTES QUMICOS:DESINFECTANTES
MECANISMO DE ACCIN
Desnaturalizacin y coagulacin
de protenas (Ej. Alcoholes)
Oxidacin de distintos componentes:
Cl, xido de etileno
Alteracin de permeabilidad de la
membrana (Ej. Agentes surfactantes,
alcoholes)
Combinacin radicales de protenas y
cidos nuclecos (Ej. aldehdos, xido de
etileno)
 Agentes Qumicos (desinfectantes)

Alcoholes, fenoles, sales de metales pesados:

denaturalizan las protenas.

Agentes oxidantes: oxidan los grupos SH de las

protenas.

Agentes alquilantes: sustituyen los tomos de H por

radicales alquilo.

Detergentes: se insertan en la membrana celular e

interfieren con sus funciones.
CARACTERSTICAS IDEALES DE UN DESINFECTANTE

Amplio espectro

Barato Destruir

CONSERVADOR

No ser inactivado No txico

No favorecer
desarrollo de
cepas
resistentes
 Tipo de microorganismo
Nmero de microorganismo
Cantidad de materia orgnica presente
Tipo & configuracin del material que ser
tratado
Tipo & concentracin del agente qumico
Tiempo y temperatura de exposicin
pH
Humedad
REPRODUCCIN Y
CRECIMIENTO
BACTERIANO
 Fase de Latencia o Fase Retardada
No hay duplicacin inmediata de la poblacin.
La poblacin permanece sin cambio durante un
tiempo.
Las clulas aumentan su tamao.
Fisiolgicamente son muy activas. Hay sntesis de nuevo
protoplasma.
Reparan sus daos. Sintetizan metabolitos
esenciales.
La clula se ajusta a su nuevo ambiente.
Los microorganismos metabolizan pero hay retardo en
la divisin celular.
Incremento de la poblacin es gradual.
 Fase logartmica (Log)
Divisin celular regular, segn su tiempo
de generacin.
Velocidad de crecimiento mxima.
Hay uniformidad de la poblacin:
Composicin qumica, actividad
metablica, etc.
 Fase Estacionaria
Crecimiento decae en forma gradual.
Clulas mas pequeas que en fase Log.
Las bacterias son mas resistentes a agentes fsicos y
qumicos.
La transicin entre la fase Log y estacionaria implica
periodo de crecimiento desequilibrado.
La poblacin permanece constante por algn tiempo:
Hay equilibrio entre la muerte y la reproduccin celular.
Hay suspensin del crecimiento debido a:
- Agotamiento de nutrientes.
- Produccin de sustancias txicas
Fase Descendente o de mortalidad

Las bacterias mueren a una velocidad

superior a la produccin de nuevas
clulas.
Hay agotamiento de nutrientes esenciales.
Acumulacin de sustancias txicas.