UNIVERSIDAD NACIONAL

AUTNOMA DE MXICO

MTODOS DE TINCIN

BCT I (2453)
 METODOS DE TINCIN
El uso de colorantes para el desarrollo de contraste
es una herramienta recurrente en la microscopia
para poder diferenciar estructuras.
 COLORANTES

Por qu colorear una muestra?

Los diversos elementos de
los tejidos poseen
prcticamente el mismo ndice
de refraccin, lo que hace que
el reconocimiento de distintas
estructuras sea una tarea difcil.
 COLORANTE
Un colorante es un compuesto colorido que puede
transferir su color a otro cuerpo.

La coloracin es la propiedad que tienen ciertos

compuestos de poseer una absorcin selectiva del
espectro de luz. Dicho de otra manera un cuerpo
se ve de tal color porque refleja las radiaciones del
espectro de luz que no es capaz de absorber.
 TIPOS DE COLORANTES
Colorantes que diferencian los componentes cidos y
bsicos de la clula.

Colorantes especializados que distinguen los

componentes fibrosos de la matriz extracelular.

Sales metlicas que se precipitan en los tejidos y

forman depsitos de metales en ellos.
 TIPOS DE COLORACIONES

Directas: se producen por inmersin en el bao

colorante.

Indirectas: en este tipo de coloracin, el colorante no

puede actuar directamente, el objeto a colorear debe
ser tratado de antemano por otra sustancia que lo
prepare para admitir el colorante, esta se llama
mordente.
 FUNDAMENTOS QUMICOS DE LA COLORACIN

Clasificacin colorantes segn afinidad:

Colorantes nucleares o bsicos: su componente colorante

activo es una base coloreada que se combina con los cidos
nuclecos.

Colorantes citoplasmticos o cidos: su componente activo

es un cido coloreado que se combina con el citoplasma.

Colorantes neutros, tanto el cido como la base son

coloreadas.
 COLORANTES BSICOS
Reaccionan con los GRUPOS ANINICOS de los
componentes celulares:
los grupos fosfato de los cidos nucleicos (ADN y RNA),

los grupos SULFATO de los glucosaminoglucanos y

los GRUPOS CARBOXILO de las protenas. La reaccin de

estos grupos vara segn el pH.

ANILINA+ Cl-
 COLORANTES CIDOS
Los colorantes cidos se unen primero a los
componentes celulares por medio de enlaces
electrostticos de manera similar pero opuesta
a la de los colorantes bsicos. Las anilinas
cidas reaccionan con grupos catinicos, como:

los grupos amino ionizados de las protenas.

Na+ ANILINA-
 Elementos que se tien Elementos que se tien
con colorantes bsicos (ej. con colorantes cidos (ej.
Hematoxilina) son Eosina) son acidfilos:
basfilos: La mayor parte del
citoplasma no
La Heterocromatina y especializado.
los Nucleolos por los Filamentos
grupos Fosfato Citoplasmticos.
ionizados. Fibras extracelulares.
Matriz del Cartlago En todos ellos, debido
por grupos Sulfato a grupos Amino
ionizados ionizados.
 METACROMASIA
Fenmeno por el cual un colorante cambia de color
tras reaccionar con un componente celular.
Se debe a que en tejidos con altas concentraciones
de POLIANIONES, la molcula del colorante se
polimeriza entre si y sus propiedades de absorcin
son diferentes de las propiedades de las molculas
individuales.
Cromtropos:
Glucosaminoglucanos sulfatados
Nucleoprotenas
Cartlago
grnulos de los mastocitos.
El cristal violeta tambin genera
metacromasia
Azul de Toluidina tie grnulos
Principales colorantes
 Tricrmico de Masson
Principal Uso: Colgeno.

Tie:
Colgeno Verde.

Ncleo, msculo y nervios

Rojo oscuro.

Citoplasma amarillo
 Van Gieson

Principal Uso: Tejido Fibroso

Tie:
Colgeno rojo.
Ncleo azul negro
Msculos, nervios
amarillos
(+Verhoeff) fibras elsticas
negro
 Fontana Masson

Principal Uso: Melanina

Tie:
Melanina Negro.
 Plata Metenamina

Principales Usos: Hongos y

Cuerpos de Donovan

Tie:
Paredes micticas
Negros.
Cuerpos de Donovan negro
 PAS

Principales Usos: Glucgeno,

MPS neutros y Hongos,
Membrana basal.

Tie:
Glucgeno Diastasa lbil.
MPS neutros y Paredes
micticas Diastasa
resistentes.
 Reaccin positiva para
glucgeno y polisacridos
neutros.

+ DIASTASA

Reaccin positiva slo para

polisacridos neutros.
 AZUL ALCIN

Principal Uso:
Mucopolisacridos cidos

Tie
Mucopolisacridos cidos
(mucina) Azul.
 Azul de toluidina

Principal Uso:
Mucopolisacridos cidos

Tie
Mucopolisacridos cidos
Purpura metacrmico.
LA MORFOLOGA BACTERIANA SE PUEDE
OBSERVAR DE DOS MANERAS

En estado vivo.

Muertas y coloreadas
 Tincin de Gram

1884 Cristian Gram

Es una tincin diferencial

Diferencia Gram+ de Gram -.

 BACTERIAS
Las bacterias se agrupan en base a la composicin de
su pared celular.

En funcin de ella, reaccionan a determinados

colorantes.

Las que se tien con el colorante primario son

conocidas como : Gram positivas
Las que se tien con el colorante de contraste son
conocidas como: Gram negativos
 GRAM POSITIVAS

-Pared celular con grueso peptidoglicano que

retiene un colorante especfico.
-No tienen membrana externa.
 PARED CELULAR GRAM POSITIVA

Posee un polmero de peptidoglicano.

Organismos gram positivos altamente sensibles a
antibiticos b-lactmicos
cidos teicoicos confieren carga negativa a la pared
celular.
cidos lipoteicoicos anclan la pared a la membrana
plasmtica
No funciona como barrera de permeabilidad
COCOS GRAM POSITIVOS
 GRAM NEGATIVAS
-pared celular compleja,
-con membrana externa y un espacio entre
membrana interna y externa -el periplasma- que
contiene el saco de murena y abundantes enzimas.

-El peptidoglicano
es fino, por lo que
no retienen el
colorante.
 PARED CELULAR GRAM NEGATIVA

Membrana externa de bacterias gram negativas

Capa externa consituda por lipopolisacridos (LPS)
Capa interna de fosfolpidos; unida a peptidoglicano
por lipoprotenas
Protenas porinas permiten el pasaje (de pequeas
molculas) al periplasma
Protenas de enlace periplasmticas unen nutrientes,
interactan con proteinas de transporte en membrana
plasmtica para facilitar el ingreso de nutrientes.
ESQUEMA DE LA PARED GRAM POSITIVA
BACILOS GRAM NEGATIVOS
 Extensin de una fina capa
PREPARACIN PREVIA PARA LA TINCIN DE CLULAS de clulas sobre el portaobjetos

Secado al aire
Se coloca una gota de aceite de inmersin sobre el
porta y se observa con el objetivo de 100X

Fijacin por flameado del portaobjetos

Adicin del colorante lavado y secado

 PASOS DE UNA TINCIN TINCIN DE GRAM

Hacer el extendido y dejar secar

Fijar la muestra con metanol o
calor por flameado
Agregar cristal violeta y esperar 1
min, todas las clulas se teirn
de color azul prpura
Enjuagar con agua
Agregar lugol (I2 / IK) y esperar
entre 30 seg
Enjuagar con agua
Agregar acetona/ alcohol y
esperar entre 15-20seg
Enjuagar con agua
Tincin de contraste con
safranina o fuscina bsica ,
esperar 1-2 min
 Tincin de Gram

Tincin del frotis

Previamente fijado al calor,
Paso 1 con cristal violeta
Durante 1 minuto.
Todas las clulas se tien
de color azul-violeta.

Aadir Lugol,
Paso 2 dejar actuar 2 minutos

Todas las clulas siguen

Gram +
de color azul-violeta.

Decolorar con alcohol

Las clulas Gram +
Paso 3 siguen de color azul-violeta.
Las Gram negativas
se decoloran.

Tincin de contraste
Con safranina 2 minutos.

Las clulas G+
se ven azul-violeta.
Paso 4
Las G- rosas o rojas.
Gram -
 OTRAS TINCIONES:
Tincin de cido-resistencia: Detecta
bacterias acido resistentes saprfitas
(Mycobacterium tuberculosis)
(fucsina fenicada)

Tincin de esporas/ Schaeffer y Fulton:

Bacillus y Clostridium (verde de malaquita)
 TINCIN DE ZIEHL NEELSEN
Bacterias de Mycobacterium tuberculosis
usando la tincin de Ziehl Neelsen.
Se le conoce como coloracin cido
alcohol resistente y se basa en la presencia
de cidos grasos (cido miclico) de
cadena larga (50 a 60 tomos de C)
Le confieren la propiedad de resistir la
decoloracin con colorantes bsicos
(fuscina fenicada)
El colorante de contraste que se usa es el
azul de metileno.
Coloracin de Ziehl- Neelsen