CURSO ANLISIS MICROBIOLGICO EN

MUESTRAS DE AGUA

La Paz, del 25 al 29 de noviembre

Cochabamba, del 2 al 6 de diciembre
Santa Cruz, del 9 al 13 de diciembre

Coliformes totales, termotolerantes y

Escherichia coli por la tcnica de tubos
mltiples
Blga. Carmen Vargas G.
CEPIS/OPS-OMS

Centro Panamericano de Ingeniera Sanitaria

y Ciencias del Ambiente
 RELACIN ENTRE COLIFORMES
TOTALES, TERMOTOLERANTES Y E. coli

Escherichia coli

Coliformes
termotolerantes

Coliformes totales
 GRUPO COLIFORMES

BACTERIAS GRAM NEGATIVAS, NO

ESPORULADAS, FORMA DE
BASTONES, QUE FERMENTAN LA
LACTOSA CON PRODUCCIN DE
GAS, CIDO Y ALDEHDO A 35OC
 COLIFORMES TOTALES

SE USA PARA LA MEDICIN PRIMARIA DE

LA CALIDAD BACTERIOLOGICA DEL
AGUA POTABLE
PRESENTE EN AGUA CONTAMINADA POR
RESIDUOS HUMANOS O ANIMALES
NO ES PATGENO
TAMBIEN SE ENCUENTRA EN EL SUELO,
ESCORRENTA Y VEGETACIN
 COLIFORMES TOTALES COMO
INDICADOR

CONTAMINACIN FECAL RECIENTE

EFICACIA DEL TRATAMIENTO DE AGUA

DETERIORO DE LA CALIDAD DEL AGUA

EN EL SISTEMA DE DISTRIBUCIN

PROGRESO EN EL TRATAMIENTO
 TECNICA DE TUBOS MLTIPLES
Nmero ms Probable (NMP/100 ml)
USADO PARA LA FERMENTACIN DE LACTOSA
LOS RESULTADOS SE REPORTAN EN TRMINOS DEL
NMERO MS PROBABLE (NMP), QUE RESULTA DEL
EXAMEN DE RPLICAS DE TUBOS POSITIVOS Y
NEGATIVOS EN TRES O MAS DILUCIONES DE LA
MUESTRA. STE NUMERO SE BASA EN LA TEORA DE
PROBABILIDADES Y ES UN ESTIMADO DE LA DENSIDAD
MEDIA DE LOS COLIFORMES EN LA MUESTRA
LA PRECISIN DE CADA ENSAYO DEPENDE DEL NMERO
DE TUBOS USADOS POR RPLICA
LA AGITACIN ADECUADA DE LA MUESTRA (25 VECES)
PERMITE UNA MEJOR UNIFORMIDAD EN LA
DISTRIBUCIN DE BACTERIAS PRESENTES
 PREPARACIN DEL CALDO
LAURIL TRIPTOSA

NMERO DE MUESTRA MEDIO POR VOLUMEN CLT

TUBOS O POR TUBO TUBO TOTAL DE DESHIDRATADO CONCENTRACIN
BOTELLA O BOTELLA O BOTELLA MEDIO + DEL MEDIO
NICA mL mL MUESTRA mL g/L

10 10 10 20 71,2 2X

10 10 20 30 53,4 1,5X

5 20 20 30 106,8 3X

5 20 20 40 71,2 2X

1 100 50 150 106,8 3X

 PRUEBA PRESUNTIVA
USAR CALDO LAURIL TRIPTOSA COMO MEDIO DE
ENRIQUECIMIENTO.
PREPARAR LOS TUBOS DE ACUERDO A LA SIGUIENTE TABLA:

Inculo Cantidad de Medio CLT requerido

(mL) (mL) (g/L)
1 10 35.6
10 10 71.2
10 20 53.4
20 10 106.8
100 50 106.8
100 35 137.1
100 20 213.6
 PRUEBA PRESUNTIVA

PARA AGUA POTABLE, USAR: 10 TUBOS CON 10 ML (2X); 5

TUBOS CON 20 ML (3X) O UN TUBO CON 50 ML (3X). LOS
INCULOS DEBEN SER DE 10 ML, 20 ML O 100 ML
RESPECTIVAMENTE.
LOS TUBOS DEBEN INCLUIR EL TUBO DE
FERMENTACIN DURHAM O SE DEBE AADIR AL MEDIO
EL INDICADOR PRPURA DE BROMOCRESOL.
INCUBAR A 35C 0,5C POR 24 H 2H. AGITAR
SUAVEMENTE Y EXAMINAR: CRECIMIENTO,
FORMACIN DE GAS EN EL TUBO DURHAM O ACIDEZ
(AMARILLO), CASO CONTRARIO REINCUBAR HASTA
COMPLETAR LAS 48 H 3H.
 PRUEBA PRESUNTIVA

INTERPRETACIN: LA FORMACIN DE GAS EN

EL TUBO DURHAM O ACIDEZ EN EL MEDIO ES
UNA LECTURA POSITIVA PARA LA PRUEBA
PRESUNTIVA Y LOS TUBOS SE USAN EN LA
PRUEBA SIGUIENTE
LA AUSENCIA DE GAS O ACIDEZ A LAS 48 H
CONSTITUYE UN RESULTADO NEGATIVO.
EN CASO DE AGUA POTABLE, SOMETER LOS
TUBOS CON CRECIMIENTO, PERO SIN ACIDEZ
NI GAS A LA PRUEBA CONFIRMATIVA.
 FLUJOGRAMA
P
R
MUESTRA Y/O U
E
DILUCIONES
B
A

CALDO LAURIL TRIPTOSA P

incubar a 35o C x 24-48 hrs. R
E
S
U
N
sin gas, turbiedad ni gas, turbiedad y fermentacin T
fermentacin a las 24 hrs. a las 24-48 hrs. I
V
reincubar a 35o C A

sin gas, turbiedad ni

gas, turbiedad y fermentacin P
fermentacin a las 48 R
a las 48 hrs. CLVBB
hrs. Incubar a 35o C x 24-48 hrs. U
AUSENCIA DE E
B
COLIFORMES A
MEDIO EC C
T
O
E
sin gas, turbiedad ni gas, turbiedad y N
R incubar a 44,5oC x 24 hrs.
M fermentacin a las 48 fermentacin F
hrs. a las 48 hrs. I
O
R
T AUSENCIA DE COLIFORMES
sin gas, turbiedad ni gas, turbiedad y M
O
COLIFORMES TOTALES A
L fermentacin a las 24 hrs. fermentacin
E TOTALES T
AUSENCIA DE a las 24 hrs. I
R
A
COLIFORMES COLIFORMES V
TERMOTOLERANTES A
N TERMOTOLERANTES
T
E
S
 COLIFORMES
TERMOTOLERANTES

LOS COLIFORMES FECALES DISTINTOS A

E.coli PUEDEN PROCEDER DE AGUAS
ENRIQUECIDAS CON MATERIA ORGNICA
(EFLUENTES INDUSTRIALES O DE MATERIA
DEL SUELO VEGETALES), POR LO TANTO EL
TRMINO DE FECALES NO ES CORRECTO.
SE DEBE CAMBIAR LA DENOMINACIN A
COLIFORMES TERMOTOLERANTES.
 COLIFORMES
TERMOTOLERANTES

* LAS BACTERIAS COLIFORMES

TERMOTOLERANTES NO CRECEN EN
EL SISTEMA DE DISTRIBUCIN A MENOS
EXISTAN:
NUTRIENTES
TEMPERATURA ADECUADA
AUSENCIA DE CLORO
RESIDUAL LIBRE
 COLIFORMES
TERMOTOLERANTES

* LAS CONCENTRACIONES DE
COLIFORMES TERMOTOLERANTES SE
ENCUENTRAN GENERALMENTE EN
RELACION DIRECTA A LAS DE E. coli .
* AL INTERPRETAR LOS DATOS ES
NECESARIO COMPROBAR LA
PRESENCIA DE E. coli, CUANDO LOS
RECUENTOS SON ELEVADOS Y EXISTE
RIESGO SANITARIO OBSERVABLE.
 COLIFORMES
TERMOTOLERANTES

SE LES PUEDE USAR COMO INDICADORES

DE LA EFICIENCIA EN LOS PROCESOS DE
TRATAMIENTO DEL AGUA EN LA
ELIMINACION DE LA CONTAMINACION DE
ORIGEN FECAL.
 COLIFORMES TERMOTOLERANTES:
MTODO DIRECTO DE TUBOS MULTIPLES

MUESTRA

35O C 0,5 C / 3 HORAS

MEDIO A-1 44,5O C 0,2 C / 21 HORAS

GAS
CRECIMIENTO
24 HORAS

COLIFORMES TERMOTOLERANTES
CONFIRMADO
METODOS DE ENSAYO DE
E. coli

CONFIRMACIN DE E. coli A PARTIR DE

CULTIVOS DE COLIFORMES TOTALES
- TUBOS MLTIPLES
- MEMBRANA FILTRANTE

MTODOS DIRECTOS (COLILERT,

COLISURE)
 SUSTRATO DEFINIDO
(ONPG)

COLIFORMES
(Nutrientes,
indicadores especficos)

ONPG
O-NITROFENIL

b-GALACTOSIDASA
b- D- GALACTOPIRANOSIDO
(Enzima)
 SUSTRATO DEFINIDO
(ONPG)

COLIFORMES

b- d GALACTOPIRANOSIDO

Cambio de color

b-GALACTOSIDASA
(Enzima)
O-NITROFENOL
 SUSTRATO DEFINIDO
(MUG)

E. coli (Nutrientes,
indicadores especficos)

MUG
4-METIL-UMBELIFERIL

b-GLUCORONIDASA
(Enzima)
b-D-GLUCORONIDO
 SUSTRATO DEFINIDO
(MUG)

E. coli

4-METIL-UMBELIFERONA

b-GLUCORONIDASA Fluorescencia
(Enzima)
b-D-GLUCORONIDO
 ESTIMACIN DEL NMP

EL CLCULO DE LA DENSIDAD DE
COLIFORMES SE REALIZA EN TRMINOS
DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP). PARA
CADA CASO SEGN EL NMERO DE
DILUCIONES Y VOLMENES USADOS,
EXISTE UNA TABLA CUYOS LMITES DE
CONFIANZA SON DEL 95% PARA CADA
VALOR DETERMINADO
 INDICE DEL NMP PARA 5 TUBOS
USADOS CON PORCIONES DE 2O ML

LMITE DE CONFIANZA DEL

N DE TUBOS CON 95%
REACCIN POSITIVA NMP/
100 ML. (APROXIMADAMENTE)
PARA CADA 20 ML.
INFERIOR SUPERIOR

O <1,1 0 3,0

1 1,1 0,05 6,3

2 2,6 0,3 9,6

3 4,6 0,8 14,7

4 8,0 1,7 26,8

5 >8,0 4,0
FRMULA DEL NMP CUANDO LA
SERIE DE DILUCIONES ES
DIFERENTE A LA TABLA DEL NMP

NMP (TABLA)
NMP/100 mL = X 10
PRIMERA DILUCIN DEL
CDIGO USADO
 EJEMPLO DE USO DE LA TABLA
CUANDO SE USAN MAS DE TRES
DILUCIONES
1 0,1 O,01 0,001 COMBINACIN NMP/
EJEMPLO
ml ml ml ml DE POSITIVOS 100ml

a 5/5 5/5 2/5 0/5 5-2-0 5 000

b 5/5 4/5 2/5 0/5 5-4-2 2200

c 0/5 1/5 0/5 0/5 0-1-0 20

d 5/5 3/5 1/5 1/5 5-3-2 1400

e 5/5 3/5 2/5 0/5 5-3-2 1400