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Sequenciamento de DNA

SEQUENCIAMENTO
DEFINIO

Processos Bioqumicos

Determinar a seqncia de nucleotdeos

Amostras de DNA genmico, RNA, plasmdeos, cromossomos artificiais,

produtos de PCR

Considerado um dos feitos cientficos mais importantes da cincia

Projeto Genoma
SEQUENCIAMENTO

TIPOS DE SEQUENCIAMENTO

Manual

Maxam e Gilbert: Degradao qumica do DNA

Sanger-Coulson: Sequenciamento enzimtico

Automtico

Desenvolvimento dos sistemas automatizados


SEQUENCIAMENTO

Maxam e Gilbert - Mtodo de degradao qumica

Tratamento com substncias qumicas que cortam a molcula de DNA em


nucleotdeos especficos

Sanger et al. - Mtodo enzimtico

Sntese enzimtica de uma fita complementar, cujo crescimento

interrompido pela adio de um dideoxinucleotdeo.


SEQUENCIAMENTO

SEQUENCIAMENTO MANUAL
SEQUENCIAMENTO

SEQUENCIAMENTO MANUAL

A C G T

Autoradiografia
SEQUENCIAMENTO

AUTORADIOGRAFIA

A execuo de uma radiografia de um objeto ou tecido registrando-se

em uma placa fotogrfica a radiao emitida pelo material radioativo

dentro do objeto, tal como ao estudar a sntese e a localizao

do DNA dentro das clulasusando-se istopos radioativos que foram

incorporados no DNA.
SEQUENCIAMENTO

DEGRADAO QUMICA DO DNA

Marcao do DNA composto radioativo de fsforo 32 (32P)

Decomposio qumica da molcula de DNA marcada em pontos especficos

Tratamento qumico causa uma clivagem em G, C, G+A,T+C

Cada Reao em Tudo separado

Eletroforose: gel de poliacrilamida

Anlise: Autoradiografia
SEQUENCIAMENTO

MTODO ENZIMTICO

Sinonmias:

Mtodo de Sanger, Mtodo de didesoxi

1977 Sequnciamento de DNA

Sntese de DNA unifilamentar com incorporao de dNTPs e ddNTPs


SEQUENCIAMENTO

Mtodo dos didesoxinucleotdeos

Frederick Sanger

1977- Allan Maxam & Walter Gilbert / Frederick Sanger

1980 - Nobel de Qumica

Tcnica mais utilizada para anlise de sequncia


SEQUENCIAMENTO
Mtodos de Didesoxi

O processo realizado a partir de uma cadeia simples do DNA a ser


sequenciado, que servir de molde, para gerar a outra metade
complementar

A reao se processa na presena da enzima DNA polimerase que


necessita de um primer para anelar na regio 3 do fragmento a ser
seqenciado

A enzima sintetiza a cadeia adicionando nucleotdeos na direo 3-5


SEQUENCIAMENTO

Obteno da sequncia de nucleotdeos

Produto da PCR
Vetor de clonagem contendo produto da PCR

Reagentes

dNTPs
Taq
Primers ou inicidores (apenas um primers)
Fluorocromos -Diclororhodaminas
Terminadores (ddNTPs)
gua de qualidade Miliq
SEQUENCIAMENTO

ETAPAS DA REAO

Desnaturao do DNA

Anelamento dos primes

Extenso

Fragmentos sequenciados
SEQUENCIAMENTO

ELETROFORESE DOS FRAGMENTOS DE DNA

Manual

Eletroforese em gel de poliacrilamida

Automtico

Sistema de Capilar
SEQUENCIAMENTO

Incorporao dos nucleotdeos livres no marcados e marcados

ddNTPs - Nucleotdeos de terminao

Fragmentos de vrios tamanhos diferentes

A reao produz eventualmente um conjunto de DNA de diferentes

comprimentos complementares ao DNA molde que est sendo sequenciado

e terminando em cada um dos diferentes ddNTPs


SEQUENCIAMENTO

No apresentam um grupamento hidroxila OH no carbono 3 da pentose

Apresenta apenas um hidrognio

Interrompe a sntese da fita complementar


SEQUENCIAMENTO
SEQUENCIAMENTO
Manual

Os fragmentos obtidos cada qual contendo um resduo final conhecido so

separados por tamanho em gel de poliacrilamida individualmente

A T C G
SEQUENCIAMENTO

Automatizado

Os computadores identificam os produtos o que permite executar o processo

em grande escala

Detecta o sinal por programas especficos

Utiliza simultaneamente os 4 ddNTPs marcados por diferentes fluorocromos

Emite fluorescncia com comprimento de ondas diferentes

Eletroinjeo com eletroforese capilar


SEQUENCIAMENTO

Automatizado

Eliminao da montagem da placa e preparao do gel

Aplicao das amostras por eletroinjeo

Alta velocidade e resoluo na separao das amostra


SEQUENCIAMENTO

Sistema Automatizado
SEQUENCIAMENTO

Sistema Automatizado

Eeletroforese ocorre no interior de microcapilares

Matriz linear de poliacrilamida

Subistituda a cada eletroforese

Parte inferior do gel passa o feixe de lazer

Utilizao de Polmeros como substrato

Maior velocidade das reaes


SEQUENCIAMENTO

Sistema Automatizado
SEQUENCIAMENTO

Sistema Automatizado
SEQUENCIAMENTO

Imagem da eletroforese capilar


SEQUENCIAMENTO
SEQUENCIAMENTO
SEQUENCIAMENTO
SEQUENCIAMENTO
ANLISE DAS SEQUENCIAS

GenBank

EBI (European Bioinformatics Institute)

DDBJ (DNA Data Bank of Japan)

PDB (Protein Data Bank)


SEQUENCIAMENTO

ANLISE DAS SEQUENCIAS