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Madrid
29 y 30 de mayo, 2014
SEAP- IAP
Material hereditario: ADN
Nucleosoma: 8 Histonas+147 pb
Cromatina=(ADN+proteinas)
El ADN como material gentico
Capacidad de almacenamiento
de la informacin
Capacidad de replicacin
Capacidad de expresin de la
informacin
Capacidad de almacenamiento
de la informacin
Capacidad de replicacin
Capacidad de expresin de la
informacin
EXOMA
El ADN como material gentico
Capacidad de almacenamiento
de la informacin
Capacidad de replicacin
Capacidad de expresin de la
informacin
Capacidad de almacenamiento
de la informacin
Capacidad de replicacin
Capacidad de expresin de la
informacin
Severo Ochoa gan el Premio Nobel de Medicina en 1959 tras descubrir cmo se
sintetizaba el ARN
CODIGO GENTICO
43 = 64
codones
20 Aa
1e A
r
SIEMPRE
a
ATG/ Met
Codones
STOP
TAA/TAG/
TGA
Splicing alternativo
Modificaciones post-traduccionales
Los GENES se anotan en mayscula y cursiva
P53, BCR-ABL, EGFR, etc
Capacidad de almacenamiento
de la informacin
Capacidad de replicacin
Capacidad de expresin de la
informacin
Mutaciones indel: Cambio de la secuencia de codones que debe ser leda durante
la traduccin, resultando en una protena completamente diferente, que no suele
ser funcional.
Tipos de mutaciones
Tipos de mutaciones
2.- Fluidos:
Heparina
- Mdula sea
- Sangre Perifrica
EDTA
- Saliva
- Lquido Cefalorraqudeo
- Lquido Pleural
- Lquido Pericrdico
Citrato
- Lquido Asctico
Sdico
- Lquido Sinovial
Muestras Biolgicas
1) Citogentica
Convencional 3 ml de MO/SP
CARIOTIPO HEPARINA
2) Citogentica
Molecular FISH Corte OCT o
Parafina
3) BIOLOGIA
MOLECULAR Mnimo
EDTA
5 ml MO/SP Para
RQ-PCRm, 10 ml
de SP
OBTENCIN DE CIDOS
NUCLEICOS
METODOS DE EXTRACCION DE ARN
Mtodos automatizados
AC. [AC. NUCLEICO] PUREZA(Valor
NUCLEICO (g/l) ptimo)
LISAR Y
HOMOGENEIZAR
LAVAR
PRECIPITAR
ELUIR
LAVAR
PRECIPITAR
DISOLVER ELUIR
CURSO DE PRIMAVERA
PATOLOGA MOLECULAR DEL CNCER
Madrid
29 y 30 de mayo, 2014
SEAP- IAP
Tipos de PCR
Fragmento de amplificacin
Tipos de PCR: PCR anidada
Dos rondas de amplificacin con diferentes pares de primers
Reaccin 1
Primers externos
para amplificacin
de una secuencia
extensa
Reaccin 2
Primers internos
para amplificacin
de una regin SEGUNDA PCR
especifica
Aumentar ESPECIFICIDAD
mRNA
cDNA
Aplicacin.
1)Multiplex-PCR control calidad de una muestra:
amplificacin de 4 genes constitutivos distintos.
2) Multiplex-PCR LAL-B infantil: amplificacin de una
de las 4 posibles translocaciones que estudiamos.
3)ARMS-PCR: Amplificacin por PCR de Alelos
Especficos.
Tipos de PCR: PCR Mltiple
POSITIVO
Tipos de PCR: Real Time PCR (RQ-PCR): PCR Cuantitativa
CUANTIFICACION RELATIVA
CUANTIFICACION ABSOLUTA
Qumica de la Reaccin.
Bufer, MgCl2, dNTPs, Taq-Polimerasa (enzima), cebadores o
primers, reactivo fluorescente, agua ultrapura, molde
ADN.
Ciclos Trmicos.
Desnaturalizacin: Separacin de las cadenas de ADN
molde y activacin de la Taq-Polimerasa (95 C).
Hibridacin y Extensin: Reconocimiento de los primers
con su secuencia complementaria y actividad de la Taq-
Polimerasa (60C).
Tipos de PCR: RQ-PCR
Qumica de la Reaccin.
Bufer, MgCl2, dNTPs, Taq-Polimerasa (enzima), cebadores o
primers, reactivo fluorescente, agua ultrapura, molde ADN.
Ciclos Trmicos.
Desnaturalizacin: Separacin de las cadenas de ADN
molde y activacin de la Taq-Polimerasa (95 C).
Hibridacin y Extensin: Reconocimiento de los primers
con su secuencia complementariay actividad de la Taq-
Polimerasa (60C).
Tipos de PCR: RQ-PCR
Fundamento
QUIMICO
Ag. Intercalantes (SYBR Green)
Sondas de Hibridacin
Ventajas
-especificidad
-libreras de cebadores y sondas en las casas
comerciales
Desventaja
- diseo de cebadores y sonda para genes que
no se han estudiado (Primer Express)
Tipos de PCR: RQ-PCR
Qumica de la Reacci n.
Bufer, MgCl2, dNTPs, Taq-Polimeras a (enzima), cebadores o
primers, reactivo fluorescente, agua ultrapura, molde ADN.
Ciclos Trmicos.
Desnaturalizacin: Separacin de las cadenas de ADN
molde y activacin de la Taq-Polimerasa (95 C).
Hibridacin y Extensin: Reconocimiento de los primers
con su secuencia complementaria y actividad de la Taq-
Polimerasa (60C).
Tipos de PCR: RQ-PCR
FUNDAMENTO TERMICO RQ-PCR
Tipos de PCR: RQ-PCR
Producto de amplificacin
Fase exponencial
Ruido de fondo
CT muestra
Log dilucin
Tipos de PCR: RQ-PCR
expresin gnica
Tipos de PCR: PCR Digital (ddPCR)
1 2 3
X target
copies
Desventajas
Precio de la plataforma
SENSIBILIDAD 10-7
Secuenciacin (PCR modificada)
Qu es la secuenciacin?
Metodologa
Terminadores/Sanger
Pirosecuenciacin
Anlisis de secuencias
Ejemplos de secuenciacin
Sanger F et al. J Mol Biol. 1975 (3):441448
Maxam AM, Gilbert W. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 ;74(2):560-4
Cada uno de los carriles corresponde con una muestra, y cada una
de las bandas de colores con una de las bases del ADN . El
ordenador identifica color con base y dibuja un cromatograma con
los picos de colores y su correspondiente base.
Secuenciacin (PCR modificada)
Mtodo enzimtico/Teminadores/Sanger
Secuencia correcta
CROMATOGRAMA
Terminadores
Secuenciacin (PCR modificada)
Mtodo enzimtico/Teminadores/Sanger
Ventajas Desventajas
TTTTTTTTTTTTTTT
cDNA
cDNA
NNNNNN
NNNNNN NNNNNN
Gene-specific Primer
Unin especfica a la secuencia homloga
for 1-step RT-PCR
Tipos de PCR: PCR Mltiple
ARMS-PCR (Amplificacin por PCR de Alelos Especficos)
C1 C3
G
1849G>T
T
C4 C2
Control 463 pb
Mutante 279 pb
Normal 229 pb
Control Interno
Alelo Mutado
Alelo Normal