O ndice de cncer heptico na

frica grande consumidor de

amendoim, um gro altamente
contaminvel 13 vezes
maior que em outros pases
(SANTURIO, 2004)
Fungo Aspergillus se
desenvolve principalmente no A presena da
milho
aflatoxina nos
alimentos contribui
sobremaneira para mais
MICOTOXINAS de um tero dos casos de
neoplasias que tenha
relao com a dieta
(CIB, 2004)
MICOTOXINAS

Conjunto complexo de substncias

txicas, produzidas por fungos,
diferenciando-se das toxinas
bacterianas por no terem natureza
protica nem serem imunognicas
 HISTRICO
10 pragas do Egito evidncias de
micotoxinas: morte dos primognitos;
Europa/Idade Mdia- Fogo de Santo
Antonio : ergotismo (Claviceps purpurea);
Rssia/sc.XIX: aleucia alimentar txica-
angina, cefalia, vmitos e, em casos mais
graves, a leucopenia seguida de
hemorragia e morte- tricotecenos do
Fusarium (matou 100 mil russos);
Inglaterra/1960: morte de 100mil perus
que comeram farinha de amendoim com
toxinas procedente do Brasil.
1957 e 1968 - Nefropatia no leste europeu-
alimentos com ocratoxina.
25% DA SAFRA MUNDIAL DE GROS PERDIDA
EM FUNO DE FUNGOS E MICOTOXINAS

Perda na produo de
amendoim j foi de 50%
por causa da aflatoxina

Mais de 500 micotoxinas conhecidas e

produzidas por cerca de 100 espcies de fungos
pertencentes, principalmente, aos gneros
Aspergillus, Alternaria, Fusarium e Penicillium.
 QUANDO, ONDE E COMO SO PRODUZIDAS?
Produtos agrcolas esto sempre predispostos e
susceptveis contaminao por micotoxinas
durante:

a colheita;
a estocagem;

o transporte;

o processamento;

a armazenagem.

Ausncia de fungos
no implica na
ausncia de
micotoxinas
A OCORRNCIA DE MICOTOXINAS DEPENDE
DE
FATORES EXTRNSECOS E INTRNSECOS

Extrnsecos Intrnsecos

Produto vegetal;
Estao do ano;
Microbiota natural e
Condies de contaminante;
cultivo e Umidade relativa e
colheita; atividade de gua;
Armazenagem; Temperatura;
Regio e Clima. Infestao por
insetos;
% de integridade dos
gros.
FUNGOS TOXGENOS

Aspergillus

Fusarium

Penicillium
Principais micotoxinas com seus respectivos fungos produtores, substratos
e efeitos no homem e nos animais.
Principais Principais fungos
Principal toxina Efeitos
substratos produtores
Aspergillus flavus e Hepatotxica, nefrotxica,
Amendoim, milho Aflatoxina B1
Aspergillus parasiticus carcinognica.

Trigo, aveia, cevada,

Penicillium citrinum Citrinina Nefrotxica para sunos
milho e arroz
Centeio e gros em Gangrena de extremidades ou
Claviceps purpurea Ergotamina
geral convulses
Milho Fusarium verticillioides Fumonisinas Cncer de esfago

Aspergillus ochraceus e Hepatotxica, nefrotxica,

Cevada, caf, vinho Ocratoxina
Aspergillus carbonarius carcinognica.

Frutas e sucos de Penicillium expansum e

Patulina Toxicidade vagamente estabelecida
frutas Penicillium griseofulvum

Milho, cevada, Fusarium sp;

Tricotecenos Hemorragias, vmitos, dermatites
aveia, trigo, centeio Trichothecium sp

Baixa toxicidade; sndrome de

Cereais Fusarium graminearum Zearalenona
masculinizao e feminizao em sunos
PRINCIPAIS MICOTOXINAS

AFLATOXINAS
B1 e B2 = Fluorescncia azul (Blue em UV);
G1 e G2= Fluorescncia verde (Green em UV);
M= (leite- milk)
OCRATOXINA

ZEARALENONA

FUMONISINAS

TRICOTECENOS: DEOXINIVALENOL (DON),

T-2, HT-2, NIVALENOL
PATULINA
AFLATOXINAS

B1,B2,G1,G2, M1e M2;

so furocumarinas complexas
com intensa fluorescncia sob
luz ultravioleta;
B fluorescncia azul

G fluorescncia verde

so substncias cristalinas,
apolares (metanol,
clorofrmio, tolueno);
altamente estveis na
ausncia de luz UV e a
temperaturas acima de 100C
(TERMOESTVEIS)
ESPCIES PRODUTORAS

Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus

Temperatura crescimento: 12-42C, com tima a

32C;
Aw mnimo 0,80 a 37C;

Pases tropicais e subtropicais.

AFLATOXINAS
Aflatoxina B1
Substncia hepatocarcinognica, mutagnica

Pertencente ao Grupo1: carcinognico para

humanos (IARC/1993)

Aflatoxina M1
Quando o gado leiteiro alimentado com rao
contaminada com AFB1, parte desta toxina pode
ser convertida em um derivado hidroxilado, que
pode ser secretada no leite
Presente no leite e produtos derivados

Grupo 2B: agente possivelmente carcinognico

(IARC, 1993)
DADOS DA INCIDNCIA DE AFLATOXINAS EM DIFERENTES
ALIMENTOS INGERIDOS PELA POPULAO BRASILEIRA
(RODRIGUEZ-
AMAYA & SABINO, 2002).
TOXICOCINTICA
Micotoxina
Substncias
lipossolveis, Trato
absorvidas no gastrointestinal Fezes
duodeno por
difuso passiva
Sistema porta-heptico

Fgado Bile

Sistema circulatrio do Msculo

Leite, ovos
sangue

Rim

Urina
METABOLISMO
Wild C , Turner P Mutagenesis 2002;17:471-481
 ASPECTOS TOXICOLGICOS DAS
AFLATOXINAS
Micotoxinas esto, em geral, presentes em
concentraes muito baixas (ppb), que passam
desapercebidas por quem ingere o alimentos, em
virtude de no alterarem suas propriedades
organolpticas.

Entretanto, em pases com escassez de alimentos e

nos quais a populao passa fome, a qualidade do
alimento a ltima coisa a se considerar. Nestes
pases, a prevalncia de efeitos txicos agudos
(micotoxicoses), ou crnicos (carcinoma heptico)
mais elevada.
 AFLATOXICOSES INTOXICAES AGUDAS
Alteraes Hemorragias na
hepticas musculatura
1,0 ppm Aflatoxicose aguda
AFLATOXICOSES INTOXICAES AGUDAS
Sintomas aps ingesto, durante 3 semanas, de
arroz contaminado com aflatoxinas com
concentraes de 200 mg/Kg:

Edema de membros inferiores;

Dores abdominais;
Vmitos; J foi relatado um
Hepatomegalia; caso letal de uma
Necrose heptica; criana de 3 anos,
Esteatose; envolvida com a
Hipoglicemia; ingesto de arroz
Hiperamonemia; mofado contendo 10
Convulses. mg de
aflatoxinas/Kg de
alimento.
AFLATOXINAS EM RAES
AVES:
Inibio do crescimento;
Inibio dos mecanismos de resistncia
imunolgica;
diminuio da produo de ovos;
sensibilidade a machucaduras.
BOVINOS:
Alteraes reprodutivas (reduo);
reduo de peso;
reduo da produo leiteira;
contaminao do leite (Afla M1)
SUNOS:
Alteraes reprodutivas (infertilidade e
abortos);
reduo do crescimento;
 CARCINOGENICIDADE DAS AFLATOXINAS
atravs da alta frequncia de
ingesto de alimentos contaminados
com baixos teores de micotoxinas
(ng/g ou ppb), que reside o maior risco
para a populao exposta;

Existe relao causal entre ingesto

de aflatoxina e cncer heptico.

Dois tipos de interaes com cidos

nuclicos podem ocorrer: ligao no-
covalente, reversvel, e formao de
ligao covalente, irreversvel,
necessitando de ativao metablica.

O composto txico o derivado 8,9-

epxido.
O 8,9-epxido da Aflatoxina B1 forma um aduto
com a guanina no DNA
 Este produto (aduto) leva a uma quebra da
ligao entre a base e o acar, resultando em
um stio apurnico.

Normalmente, adeninas so introduzidas em

stios apurnicos, levando a uma mutao no
DNA.

G:C 0:C 0:A

0:A T:A
Ou seja, a ligao do metablito txico da
Aflatoxina ao DNA leva a uma transverso
G:C T:A, causando uma mutao no
DNA. esta mutao que ocasiona o
cncer.
RESOLUO RDC N 7, DE 18 DE FEVEREIRO
2011
(PUBLICADO EM 22 DE FEVEREIRO DE 2010 NO
DIRIO OFICIAL DA UNIO N 37, PAGINA 72-73)
 OCRATOXINA

Amidas da L- fenilalanina com isocumarinas;

Composto incolor e cristalino;

Solvel em solventes orgnicos polares e

ligeiramente solveis em gua.
 PRINCIPAIS FUNGOS PRODUTORES -
OCRATOXINA

Penicillium verrucosum
- Pases de clima temperado
- T tima = 20C
- aw mnimo = 0,80
- comum em cereais, queijo,
cerveja

Aspergillus ochraceus
- T tima = 24 - 31C
- aw min = 0,77 a 25C
- Alimentos de Aw (gros,
cereais, milho,soja)
 PRINCIPAIS FUNGOS PRODUTORES -
OCRATOXINA

Aspergillus carbonarius

- T tima = 32 35C;
- Frutas secas, uva, vinho, caf;
- Nefrotxica e nefrocarcinognica;
- Nefropatia endmica dos Balcs.
OCRATOXINA NO CAF

Aspergillus ochraceus e Penicillium verrucosum

Algumas populaes europias registram alta
incidncia de nefropatias decorrentes da ingesto
da ocratoxina A.
Quantidade de ocratoxina que ingerimos diminuda pois:

O caf no consumido em gros;

Torrao elimina 90% da toxina;
Filtragem do p retm parte da toxina.
ASPECTOS TOXICOLGICOS - OCRATOXINA
Lipossolvel, comporta-se como eletrlito fraco, sendo mais absorvida
no estmago e duodeno.

Sofre efeito de primeira passagem (fgado)

Os rins so os rgos onde a Ocratoxina mais se distribui

Excreo renal da forma biotransformada e fecal

nefrotxica e nefrocarcinognica

Parece estar associada com a nefropatia endmica dos Balcs

observada nas zonas rurais da Bulgria, Romnia e Ioguslvia.

ndices de toxicidade: Ingesto Semanal Aceitvel provisria= 0,1

g/Kg peso corporal
RESOLUO RDC N 7, DE 18 DE FEVEREIRO
2011
(PUBLICADO EM 22 DE FEVEREIRO DE 2010 NO
DIRIO OFICIAL DA UNIO N 37, PAGINA 72-73)
Aplicao imediata
Limite mximo tolerado (ppb)
Resoluo RDC N 7, de 18 de fevereiro 2011
FUMONISINAS

FB1, FB2 e FB3

So polilcoois, esterificados
com cido carboxlico 1,2,3;
Baixa lipossolubilidade;

Fungos produtores:

- Fusarium verticillioides;

- Fusarium proliferatum

- Contaminantes do milho,
principalmente
ASPECTOS TOXICOLGICOS - FUMONISINAS
Milho contaminado com fumonisinas destinados
alimentao humana tem sido associado com
uma alta incidncia de cncer de esfago em
populaes do Sul da frica, podendo tambm
exercer importante promoo de cncer heptico
em algumas regies da China.

Classe 2B substncias potencialmente

carcinognicas
FUMONISINAS- LEUCOENCEFALOMALACIA
(LEME)
LEUCOENCEFALOMALACIA
(LEME)
Esta afeco caracterizada por necrose da
substncia branca de um ou dos dois hemisfrios
cerebrais. De aparecimento sbito, cursa com
anorexia, depresso, andar em crculos,
tonteira , comprometimento da viso,
hiperexcitabilidade, decbito e morte aps
poucas horas ou at 48 horas do incio dos sintomas,
sendo esta uma caracterstica comum da LEM

A leucoencefalomalcia ( L E M ), doena
neurotxica fatal que acomete eqinos, causada
pela ingesto de alimentos mofados .
 RESOLUO RDC N 7, DE 18 DE FEVEREIRO
2011
(PUBLICADO EM 22 DE FEVEREIRO DE 2010 NO
DIRIO OFICIAL DA UNIO N 37, PAGINA 72-
73)

Aplicao imediata
Limite mximo tolerado (ppb)
ZEARALENONA

Intermedirio da sntese
de hormnios e
promotores de
crescimento;
Patgeno de plantas;
T tima = 24-26C;
Aw mn = 0,90;
Fungos produtores:
Fusarium graminearum.
 OCORRNCIA
Principalmente milho

Cevada, aveia, sorgo, trigo, arroz.

AO BIOLGICA
Est relacionada com a capacidade de competir
com o receptor do estradiol hormnio sexual

MANIFESTAES CLNICAS
Estrogenismo em fmeas: inchao e avermelhamento da
vulva; inflamao uterina; aumento da secreo vaginal.,
atrofia dos ovrios, atrofia dos testculos infertilidade.
Pode causar o crescimento e lactao das glndulas
mamrias em machos e em fmeas.
 TRICOTECENOS

Produzidos por
espcies do gnero
Fusarium
Compreendem mais de
170 compostos:
Desoxinivalenol
Encontrados em: arroz,
trigo, aveia, centeio,
sorgo, amendoim, feno,
produtos processados
tipo corn flakes
AO BIOLGICA
Tricotecenos so substncias com potente ao
irritativa local:
1. Inibem a peptidiltransferase (sntese protica);
inibem a produo de energia, o que afeta
funcionamento das membranas celulares;
2. Atuam sobre as aminas biognicas no crebro

MANIFESTAES CLNICAS
Irritao local da pele e mucosas;
Alteraes neurolgicas (recusa da alimentao e
desorientao do vo em aves)
Hemorragia

Aplasia medular (destruio da medula ssea)

Imunossupresso
 Tricotecenos: Armas
biolgicas????

Em setembro de 1981, a Secretaria de Estado

norte-americana declarou publicamente ter
evidncias do uso militar de potentes
micotoxinas no Sudeste Asitico. Segundo o
Departamento de Estado, a vegetao do
Campucha estava contaminada, ao nvel de
ppm, por trs micotoxinas do grupo dos
tricotecenos, substncias produzidas por
fungos do gnero Fusarium .
Os EUA alegaram, na ocasio, que se tratava de agresso qumica por parte da
Unio Sovitica. Este episdio ficou conhecido como o da Chuva Amarela (Yellow
Rain). Uma grande controvrsia se estabeleceu entre cientistas norte-americanos e
canadenses, com acirrada polmica sobre a possibilidade de se tratar de uso militar
de toxinas ou de ocorrncia de tricotecenos ligada a algum evento natural. Para
complicar, logo se evidenciaram discrepncias entre a histria governamental e os
fatos experimentais. Um laboratrio do Exrcito constatou 20 casos positivos em 60
amostras de sangue, urina e tecidos. Porm, suspeitou-se que as toxinas
encontradas resultassem da ingesto recente de alimentos mofados. Finalmente,
foi proposto que as contaminaes provinham de fezes de abelhas (que defecavam
durante o vo) na forma de "densas misturas com plen e outros materiais
Fonte: http://www.nossofuturoroubado.com.br/arquivos/abril_09/bbs_de_quimica.html
Resoluo RDC N 7, de 18 de fevereiro 2011
 PATULINA
Produzida por diversas espcies de Aspergillus, Penicillium e
Byssochlamys
Principal espcie: Penicillium expansum contaminante de ma e
outras frutas

Solvel em gua

O fungo pode ser encontrado na parte ntegra do fruto, mas para

que se desenvolva e produza a micotoxina, necessrio que o fruto
esteja danificado por danos fsicos ou ataque de microrganismos ou
larvas e insetos.
 PATULINA
Os fungos produtores de patulina dificilmente so
destrudos pelo aumento da temperatura, pois formam
ascsporos.

Assim clulas sobreviventes podem produzir a

micotoxina no produto final, ou seja, no suco de ma.

Para prevenir contaminao por patulina:

Utilizar frutos de boa qualidade
Aplicar nos frutos anidrido sulfuroso inativa patulina
Pasteurizao remove at 4%
Despectinizao at 1,6%
Concentrao at 18%
ASPECTOS TOXICOLGICOS - PATULINA
Intoxicaes agudas:
Edema pulmonar

Processos hemorrgicos

Danos nos capilares hepticos, do bao e dos rins

Edema cerebral

o Possui provvel atividade carcinognica

Resoluo RDC N 7, de 18 de
fevereiro 2011
Nveis de toxinas em alimentos e gros permitidos em diferentes pases
Pas/Produto Micotoxin Limite ppb ou g/kg
a
Argentina
Alimentos infantis B1 0
Amendoim, milho e derivados B1 5
B1B2G1G2 20
Farelo de soja B1 30
Leite in natura e em p M1 0,05
Produtos lcteos M1 0,5
Uruguai
Alimentos infantis B1B2G1G2 3
Leite e derivados M1 0,5
Amendoim, soja e frutas secas B1B2G1G2 30
Milho e cevada zearalenon 200
a
Arroz, cevada, caf e milho ocratoxina 50
CE- Comunidade Europia
Cereais em geral, frutas secas, B1B2G1G2 4
condimentos
Nveis de toxinas em alimentos e gros permitidos em diferentes pases
Pas/Produto Micotoxin Limite ppb ou g/kg
a
Estados Unidos
Raes de crescimento - aves e sunos B1B2G1G2 20
zearalenona 2
Rao final sunos B1B2G1G2 200
Produtos lcteos M1 0,5
MERCOSUL
Milho B1B2G1G2 20
Farelo de milho B1B2G1G2 20
Amendoim e subprodutos B1B2G1G2 20
BRASIL (Res. RDC 274, 2002)
Leite fluido, amendoim e milho M1 0,5
Leite em p M1 5
Alimentos para consumo humano B1B2G1G2 20
(somatrio das 4 aflatoxinas)
Matrias primas e raes- (Portaria B1B2G1G2 50
MA/SNAD/SFA 07 de 09/11/88).
Fonte: FONSECA ( Micotoxinas), BAKKER-ARKEMA(1999); CIB,
 Como eliminar a micotoxina do
alimento?
A melhor maneira de se controlar a presena de micotoxinas em
alimentos evitar sua formao controlar crescimento fungos

1. Processos fsicos:
Limpeza de gros (remoco de fumonisinas em milho)
Temperaturas acima de 150-220 C
Microondas em alta potncia

2. Processos qumicos
cidos, bases, perxido de hidrognio, bissulfito de sdio
descontaminao qumica de raes
Figos secos tm sido descontaminados com bissulfito de
sdio e com perxido de hidrognio destri aflatoxinas e
desoxivalenol
 Como eliminar a micotoxina do
alimento?
3. Processos biolgicos:
Destruio de aflatoxinas por microrganismos como
Flavobacterium aurantiacum e cepas no produtoras de
Aspergillus flavus.

4.Processamento dos alimentos

Refinao de leos ( aflatoxina)
Torrefao do caf ( ocratoxina)
Filtrao do p do caf ( ocratoxina)
Concentrao do suco de ma ( patulina)
Moagem de milho em meio mido ( zearalenona, aflatoxinas
e fumonisinas em amido)
Produo da cerveja (a ocratoxina no malte totalmente
destruda)
 Controle Biolgico
Uma cepa competitiva
de A. flavus que no
produz aflatoxina
aplicada nas plantaes
de amendoim. Esta
cepa se prolifera e
compete com a cepa
produtora de
aflatoxinas, diminuindo
a quantidade desta
ltima.
 PROBLEMA:

Fungo Aspergillus se beneficia do ataque de

insetos e libera micotoxinas

SOLUO:
J existe um milho geneticamente modificado que contm
um gene da bactria Bacillus thuringiensis (Bt), o qual faz
a planta produzir uma protena txica para determinados
insetos, reduzindo os ataques em at 90%.
MICOTOXINAS
Mtodos de Anlises
MTODO IDEAL
Um mtodo ideal eficiente e adequado para
anlise de micotoxinas deve ser simples, rpido,
preciso, barato, automatizado, sensvel e seletivo.

A seqncia analtica bsica para a maioria dos

mtodos qumicos usados em anlise de
micotoxinas : (a) preparo das amostras; (b)
extrao; (c) limpeza; (d) deteco e quantificao
e (e) confirmao.
ETAPAS DA PESQUISA DE MICOTOXINAS EM
ALIMENTOS

A. Preparo da amostra;

B. Extrao;

C. Limpeza: remoo de interferentes;

D. Deteco e quantificao;

E. Confirmao.
A. PREPARO DE AMOSTRA

A coleta da amostra e seu preparo o passo mais importante no

procedimento de anlise das micotoxinas. Ela deve ser
representativa do lote a ser analisado.
Instrues bsicas na coleta de amostras para a deteco da
presena de micotoxinas: publicadas pela AOAC Association of
Official Analytical Chemists;

Acondicionamento: amostras devem ser acondicionadas de modo

que se evite a produo de toxinas aps a coleta;

Para a anlise, a sub-amostra removida da amostra triturada, e

a aflatoxina extrada e quantificada.
A. PREPARO DE AMOSTRA
A amostragem , indubitavelmente, o fator mais importante para
a variao verificada nas anlises de aflatoxinas em produtos
agrcolas em gros. Este fato devido distribuio
extremamente desuniforme das aflatoxinas nos produtos
agrcolas no processados;

Devido heterogeneidade, os alimentos foram classificados de

acordo com a possvel distribuio das toxinas:
- Tipo I Alimento onde esperado alto grau de heterogeneidade de
contaminao: gros, sementes, nozes, frutas secas, gros
grosseiramente triturados;
- Tipo II Alimento onde esperado exibir contaminao
homognea: lquidos e p;
- Tipo III Alimento que exibe heterogeneidade intermediria:
farinhas, pastas, tortas de oleaginosas e cereais secos
(SCUSSEL,1998).
B. EXTRAO
Solventes usados: clorofrmio, acetona, metanol,
acetonitrila, benzeno, acetato de etila, hexano e
gua;
Muitas micotoxinas so solveis em solventes
orgnicos, mas pouco solveis em gua. A
extrao freqentemente aumentada pela gua,
que no caso de cereais, por exemplo, dilata e
amolece as clulas, facilitando a penetrao e a
extrao pelos solventes orgnicos.
Para extrao de lipdeos: hexano;

Tcnicas fsicas empregadas: agitao em alta

velocidade durantes alguns minutos ou agitao
vigorosa por no mnimo 30min;
Filtrao: para remover a parte slida.
C. LIMPEZA: REMOO DE INTERFERENTES

As tcnicas mais comuns de limpeza so extrao

de gordura, cromatografia de coluna, precipitao
e partio lquido-lquido;

Aps a limpeza, concentrar: atravs de um

banho de gua sob presso reduzida em um
evaporador rotatrio, ou utilizar um banho de
gua sob nitrognio, banho-maria (temperatura
sempre inferior a 50C).
 D. DETECO E QUANTIFICAO
Maioria utiliza a CCD para quantificar: sensvel e de baixo custo,
vrias amostras simultaneamente. A quantificao na CCD feita
atravs de comparao visual da intensidade de fluorescncia da
amostra com a do padro.

E. CONFIRMAO

O tratamento da cromatoplaca com vrios reagentes largamente

usado para identificao de micotoxinas, por exemplo: ao vaporizar
a cromatoplaca com H2SO4 50% ou cido trifluoroactico (TFA)
para as amostras positivas, as manchas apresentando cores
caractersticas para aflatoxinas mudam para amarelo. Se
negativo, as cores no mudam de cor.
OUTROS MTODOS DE DETECO
DE MICOTOXINAS
continuao
DETECO E QUANTIFICAO
Tcnicas fsico qumicas:
1. CCD (Cromatografia em camada delgada);
2. CLAE (Cromatografia lquida de alta eficincia);

Tcnicas biolgicas: imunoensaios

1. Radioimunoensaio (RIA)*- utiliza istopos radioativos;
2. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)*;

*baseadas na competio de ligao entre toxina no marcada

proveniente da amostra e a toxina marcada sobre locais especficos
do anticorpo

1. imunoafinidade que uma tcnica cromatogrfica

baseada diretamente na ligao antgeno com anticorpo
fixado numa coluna de cromatografia).
 CROMATOGRAFIA
TCNICA UTILIZADA PARA
SEPARAO DE MISTURAS
COMPLEXAS DE
SUBSTNCIAS.

Amostra Solvente fluindo

aplicada continuamente a partir de
um reservatrio
INICIALMENTE
UTILIZADA PARA
SEPARAO DE
COMPOSTOS
COLORIDOS
(CROMO: COR E

GRAFIA:
PINTURA)

Eluio e separao
Eluio e do componente 2
separao do
componente 1
 CROMATOGRAFIA

O mtodo baseia-se na migrao diferencial das substncias em um

sistema cromatogrfico, constitudo pela mistura a ser separada,
pela fase mvel e pela fase estacionria.

1. Mistura a ser separada

(substncias orgnicas com
diferentes solubilidades,
afinidades etc)
Componentes de uma
cromatografia
2. Fase estacionria: constitudo
por um slido ou um lquido

3. Fase mvel: constituda por um ou

mais solventes ou por gases.
 CROMATOGRAFIA DE ADSORO
Camada Delgada (CCD)

Caractersticas:
-Fase estacionria: slido polar finamente dividido como slica (SiO2
x H2O), alumina (Al2O3).

- Fase mvel: Solventes orgnicos ou mistura de solventes com

polaridades variadas, dependendo do que se deseja separar.
Normalmente utiliza-se solventes apolares.

Princpio:
As substncias polares adsorvem-se na fase estacionria polar,
ficando mais fortemente retidas. Ao se passar um solvente apolar,
este carregar primeiramente as substncias apolares (migraro
primeiro).
 CROMATOGRAFIA DE ADSORO Camada
Delgada (CCD)

Cromatografia
analtica: para
pequenas
quantidades de
material.

Placa

Topo
da
placa

Incio Final Solvente

CCD CROMATOGRAFIA EM CAMADA
DELGADA
CCD CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
 CROMATOGRAFIA LQUIDO-LQUIDO
Cromatografia lquida de alta eficincia
(CLAE ou HPLC)

Princpio:
Coluna contendo fase estacionria finamente dividida. Pode ser um
slido (cromatografia por adsoro) ou um lquido com alto ponto de
ebulio empacotado. Material muito utilizado: octadecil sulfato
fase reversa.
Como fase mvel podem ser utilizados tampes aquosos ou
solventes orgnicos.
Ocorre aplicao de uma alta presso na entrada da coluna,
fazendo com que o material seja separado muito rapidamente.
Este sistema permite alta perfomance e reprodutibilidade
(condies constantes e padronizadas).
CROMATOGRAFIA LQUIDO-LQUIDO
Cromatografia lquida de alta eficincia
(CLAE ou HPLC)

Injetor

Bomba

Coluna
Reservatrio

Detector

Detectores de Ultra
violeta, luz visvel e
ndice de refrao.
DETECO E QUANTIFICAO: CLAE,
AFLAPREP, KOBRA CELL
CLAE- mais sensvel e mais rpida, s que o custo do
equipamento alto;

Mtodo (CLAE) utilizando coluna de imunoafinidade

(AFLAPREP) para clean-up das amostras e
derivatizao ps-coluna para AFB1 e AFB2 com clula
eletroqumica KOBRA Cell :
- componente principal do AFLAPREP a coluna de
imunoafinidade, contendo no gel uma suspenso de
anticorpo monoclonal fixado em suporte slido. O
extrato da amostra passado por esta coluna. Se
alguma aflatoxina estiver contida na amostra ir ser
retida pelo anticorpo suspenso no gel. A toxina ligada ao
anticorpo eluda da coluna com metanol ou
acetonitrila. O eluato analisado via CLAE.
DETECO: CROMATOGRAFIA DE
IMUNOAFINIDADE (IAC)
 DETECO E
QUANTIFICAO:
CLAE,
AFLAPREP,
KOBRA CELL
necessrio que se faa a
derivatizao das AFB1 e
AFG1 a fim de realar sua
fluorescncia sob a luz UV
e faz-las detectveis mais
facilmente. A KOBRACell
(R-BIOPHARM RHNE
LTD, 2004) uma clula
eletroqumica que gera o
agente de derivatizao,
bromo, do brometo de
potssio presente na fase
mvel.
 DETECO E QUANTIFICAO: CLAE,
AFLAPREP, KOBRA CELL

Cromatograma de pool de padres Cromatograma de pool de padres

sem KOBRA Cell com KOBRA Cell
DETECO: IMUNOENSAIO
ELISA (ENZYME-LINKED
IMMUNOABSORBENT
ASSAY)
Baseia-se na interao entre
antgeno (aflatoxina) e anticorpo.

Para resultados mais precisos,

com instrumentos de leitura
como um espectrofotmetro ou
uma leitora de microplacas por
absorbncia, pode-se obter at
mesmo a concentrao. Este j
chamado de ELISA
QUANTITATIVO. Normalmente,
para isto, deve-se possuir
padres, com valores de
concentrao conhecidos. A partir
destes padres, pode-se traar
uma curva de calibrao.