Laboratorio No.

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Determinacin de la
Quimiotaxis.

Profesor.
MAURICIO PEREA
 QUIMIOTAXIS

El quimiotaxis Proceso por el cual las bacterias y otras

clulas de organismos se mueven de acuerdo con la
concentracin de ciertas sustancias qumicas en su medio
ambiente.
El primero en observarla fue Leuwenhook en 1703.
La primera descripcin erudita fue por T.W. Engelmann en
1881
E.Metchnikoff contribuye con los pasos iniciales en la
fagocitosis. 1908.

Dr. Denis Breins, estudios sobre quimiotaxis en E. coli.

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DEFINICIONES
QUIMIOTAXIA Proceso de atraccin
de fagocitos hacia los patgenos

QUIOMIOTAXIS Prueba de laboratorio

Que mide la capacidad de migracin
del neutrofilo

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DEFINICIONES:

Quimiocinas: Clase especial importante

de citocinas secretadas por clulas
endoteliales.

Marginacin: Proceso mediante el cual

el Neutrfilo se adhiere a una pared
vascular.

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 Laboratorio No. 11
Determinacin de la Quimiotaxis.
La capacidad de reconocer, fagocitar, destruir
y digerir un microorganismo invasor se
deivide en:
Cascada de Emigracin
Cascada de Destruccin.

La Cascada de Emigracin: se inicia con la

Marginacin del Neutrfilo de la circulacin
sangunea.- Esto puede ocurrir sin que se de
adherencia ni agregacin.

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 MARGINACION

Se realiza en tres fases:

1- Deslizamiento
2, Activacin
3- Adhesin.
La primera fase, mediada por selectinas
(selectina P y E, las cuales se enlazan a la
superficie de los neutrfilos
La L-selectina, enlaza sobre la superficie
endotelial activada.-

Estos 3 tipos de selectinas establecen el

contacto inicial entre el neutrfilo y la
pared vascular. 7
 Laboratorio No. 11
Determinacin de la Quimiotaxis

Con el proceso de adherencia, el

neutrfilo se fija al endotelio vascular y se
extiende sobre su superficie.

Adherencia se puede subdividir con base

en la fuerza de unin en:
Adhesin (proceso pasivo, reversible) y

Anclaje (proceso dependiente del

consumo de energa no reversible
fcilmente. 8
 DIAPEDESIS

Diapdesis: movimientos de los

neutrfilos a travs de las reas de unin
que se localizan entre las clulas
endoteliales, abrindose paso por la
membrana basal.

Este proceso es facilitado por liberacin de

la proteasa por el neutrfilo en emigracin.

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 Laboratorio No. 11
Determinacin de la Quimiotaxis

El Neutrfilo tiene 2 modos

fundamentales de emigrar hacia los
tejidos y cavidades corporales :
1-Emigracin Aleatoria (al azar) y
2-Emigracin dirigida (respuesta a
un estmulo quimiotctico.)

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Deformacin del
Neutrfilo.

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 QUIMIOTAXINAS

Son sustancias naturales o sintticas que

orientan a los neutrfilos hacia la
concentracin de un agente.
En todas las clulas existe un receptor para la
quimiotaxina.

Forlmilmetionina C5a
Coagulacin Cininas
Productos de la activacin de monocitos,
Mastocitos Macrofagos, Neutrofilos
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Tcnicas para la Determinacin de
la Quimiotaxis.
La Quimiotaxis puede ser evaluada o
medida por varios Mtodos:
Cmara de Boyden
Prueba de Agarosa
Prueba de Orientacin
Prueba de la Inhibicin de la
Migracin de los Macrofagos (MIF)

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Cmara de Boyden:
Es una Cmara con dos niveles uno
superior y otro inferior. Separados por una
membrana de microporos

En el nivel superior se colocan los PMN, y

en el inferior se coloca un quimioatrayente

Las clulas al intentar pasar a la cmara

inferior quedan atrapadas en los poros de
la membrana . Pasado un tiempo se retira
la membrana y se observa al microscopio
la migracin de la clulas.
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 Prueba de Orientacin:
Utiliza la Cmara de Zygmond.
Es una Lmina con dos pozos de 5mm de
lado x 1mm de profundidad, separados
entre s por un puente de 1mm de ancho.
En uno de los pocillos se coloca un
quimioatractante en el otro buffer.
Sobre ellos se coloca una lmina con
clulas sobre cada pocillo una vez hagan
contacto con los orificios.
Se incuban por 30 minutos a 37oC.
Se lee al microscopio de Contraste de fase
para determinar la orientacin.
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 Prueba de Inhibicin de la
Migracin de los Macrfagos:
Se colocan clulas de exudado peritoneal
de animales en contacto con un medio de
cultivo.
Los macrfagos migran por el tubo capilar
hacia el medio de cultivo en forma de
abanico.
Se colocan Linfocitos y un Antgeno
contra el cual estn sensibilizados , se
produce el factor antimigracin de los
Macrfagos.

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 Tcnica de Quimiotaxis:
Procedimiento: Iera. Fase: Extraccin de Sangre:
1.- Servir 0.1 cc de Heparina en 2 tubos 16 x 100.
2.- Extraer 18 cc de sangre venosa al paciente en estudio y
colocar 9cc en cada tubo.
3.- Una vez extrada la muestra, mezclar e incubar en bao Mara
(37 o C) por 2 horas.
Nota : durante esta incubacin se puede iniciar la 2da. fase
Preparacin del Medio de agar y el reactivo de Trabajo.
4.- Al cabo del tiempo, extraer el plasma en tubo plstico y
centrifugar a 45 segundos.
5.- Eliminar el sobrenadante y resuspender el botn en 5 cc de
Medio de trabajo( MEM 199, Suero Fetal Bovino, Bicarbonato y
Glutamina).
6.- Colocar esta resuspencin sobre 4 cc de Ficoll Histopaque en
tubo cnico, aadir medio de trabajo hasta 13 ml.
7.- Centrifugar por 30 minutos a 400 g , ( 1800 r.p.m.).
8.- Terminada la centrifugacin se decanta todo el contenido del
tubo, el botn que queda en el fondo del mismo se resuspende en
4 cc de Medio de trabajo y se lava 3 veces por 3 minutos de
centrifugacin (aproximadamente 3400 r.p.m.)
9.- Terminado el ltimo lavado, se decanta todo el contenido del
tubo y el botn se rompe con el remanente de medio de trabajo
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que queda en el tubo.
 Tcnica de Quimiotaxis:
II Fase: Preparacin del Medio de Agar:
1.- Tomar una botella de 100 cc de agua destilada.
2.- pesar 1 gramo de Agarosa.
3.- Echar todo en un Erlenmeyer agitar, mezclar.
4.- Encender el autoclave
5 .- Programar el Mdulo Especial.
6.- Esterilizar a 115 oC por 7 minutos.
7.- terminado el tiempo sacar el agar estril (debe estar
blanco transparente)y colocarlo en el bao Mara a 37 o
C.
8.- Esperar un rato, dejar salir todo el humo caliente y
agregar al agar MEM 199 ,antibitico antimicotico,
bicarbonato y albmina bovina.
9.- Servir 10 cc en los platos petri.
10 .- Dejar solidificar e incubar en CO2, hasta su Uso.
Antes de servir la muestra colocar el plato de 5 a 10
minutos en fro (4oC).
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 Tcnica de Quimiotaxis.
III Fase- Tratamiento de la Muestra e Incubacin:
1.- Tomar el plato de la refrigeradora y hacer 3 orificios de acuerdo a
la plantilla. retirar, todo el agar y el liquido de cada pocillo .
2.- Tomar la muestra y servirla en cada pocillo central, en el pocillo
anterior colocar una mezcla de suero del paciente y zymosan, la cual
debe haber sido preparada con anterioridad, en la parte posterior
servir medio de trabajo. En cada pocillo servir 5 ul.
3.- Terminado de servir cada muestra por duplicado en cada plato,
incubar boca arriba en la incubadora de CO2 por espacio de 2 a 3 hrs.
4.- Terminado este tiempo sacar de la incubadora de CO2 e incubar
boca abajo en la refrigeradora a 4 o C. por toda la noche.

IV Fase- Tincin e Interpretacin:

1.- Luego de la incubacin en la refrigeradora de 4 o C.,
2.- Sacar y servir 3 cc de metanol, e incubar por 30 minutos a 4 o C.
3.- Terminado el Tiempo Decantar el Metanol y servir 3 cc de
formaldehdo por 30 min.
4 .- Terminado el tiempo Decantar y desprender el agar , teir con
tinte Wrigth.
5.- Dejar Secar y leer la migracin de las clulas hacia el estmulo.

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Resultados.

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Determinacin de la
Fagocitosis
Determinacin de la
Fagocitosis
Determinacin de la
Fagocitosis
Determinacin de la
Fagocitosis
Resultados.

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 DILUCION
Reducir la concentracin de una
sustancia, se comienza con una
determinada concentracin de un
soluto y se aade mas solvente,
bajando la concentracin del mismo.

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 Por que se trabaja con
diluciones en el laboratorio
Por que se necesita a veces medir y
pesar cantidades muy pequeas.
Es mas fcil entonces partir de una
concentracin mayor a una menor.
Las concentraciones comerciales
concentraciones stock y se usan
a concentraciones working

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SOLUCION STOCK-MADRE
Es una solucin que tiene una
concentracin mayor y de la cual se
pueden preparar a travs de
diluciones las concentraciones de
uso diario.
Solucin NX
PBS 10X

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Formula til en laboratorio

C1V1=C2V2

M1V1=M2V2

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Solucin en proporcin
Es cuando se hace una mezcla en
proporcin entre el soluto y
solvente. 1:3, 3:5, 4:3

De esta manera se hacen mezclas

en el laboratorio.

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 Unidades de concentracin
% p/p porcentaje masa en masa
(g de soluto por cada 100 g de solucin)

%p/v porcentaje masa en volumen

(g de soluto por cada 100 ml de solucin)

%v/v porcentaje volumen en volumen.

(ml de soluto por cada 100 ml de
solucin) 38
 Unidades de concentracin
M: Molaridad nmero de moles de soluto
por cada litro 1000 ml de solucin.

M:Molalidad nmero de moles de solutos

por cada Kg de solvente.

N: Normalidad numero de equivalentes

de un cido o una base por cada litro de
solucin 39
Diluciones seriadas
Es cuando hacemos varias
diluciones tomando una por del
soluto y usamos un diluyente
adecuado para realizar la misma es
muy til en serologa.

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