DIAGNSTICO GENETICO

MOLECULAR
 DIAGNSTICO GENETICO MOLECULAR
El campo del diagnstico molecular comenz en la segunda mitad del
siglo XX, con la aplicacin de mtodos de bajo rendimiento, como la
- Determinacin convencional del cariotipo para el reconocimiento de
los trastornos citogenticos y
- Las pruebas basadas en el ADN, como la inmunotransferencia de
Southern.
Con el avance de la tecnologa se desarrollaron nuevas mtodos de
diagnstico molecular.
 INDICACIONES PARA LA REALIZACIN DE
LAS PRUEBAS
Consideraciones analticas
El personal responsable del diagnstico molecular se centra en aspectos: sensibilidad,
especificidad, exactitud y reproducibilidad, as como factores prcticos.
Indicaciones para el anlisis de alteraciones genticas hereditarias
Las pruebas prenatales han de plantearse en todos los fetos con riesgo de anomala citogentica.
Posibles indicaciones son:
Edad avanzada de la madre.
Progenitor portador conocido de una alteracin gentica.
Anomalas fetales observadas en la ecografa.
Pruebas sanguneas de rutina maternas que indiquen riesgo aumentado de sndrome de Down u
otra trisoma.
Antecedentes familiares.
 Las pruebas prenatales se realiza en clulas obtenidas por amniocentesis,
biopsia de vellosidades corinicas o sangre de cordn umbilical.
Los padres con riesgo conocido de tener un hijo con trastornos genticos
pueden optar por las pruebas genticas en embriones concebidos in
vitro antes de la implantacin uterina, eliminando la transmisin
generacional de una enfermedad familiar.

En recin nacidos o nios, las indicaciones pueden ser las siguientes:

Malformaciones congnitas mltiples.
Sospecha de un sndrome metablico.
Retraso mental y/o retraso del desarrollo no explicados.
Sospecha de aneuploida.
Sospecha de enfermedad monognica.
En pacientes de mayor edad, las pruebas se orientan hacia enfermedades
genticas que se manifiestan en pocas tardas de la vida. Las indicaciones
son las siguientes:
Sndromes de cncer hereditario
Enfermedades monogenicas atpicamente leves.
Trastornos neurodegenerativos.
Indicaciones del anlisis de alteraciones genticas adquiridas
En los trastornos adquiridos es importante identificar las secuencias de acidos
nucleicos o las aberraciones. Las indicaciones son:
Diagnstico y tratamiento del cncer.
Diagnstico y tratamiento de las enfermedades infecciosas.
 METODOS DE DIAGNOSTICO MOLECULAR DE
TRASTORNOS GENETICOS
REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA
Desarrollada en 1986 por Kary Mullis, motivo por el cual recibi en
1993 el Premio Nobel de Qumica por este descubrimiento, el
objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento
de ADN.
Y permite identificar con una muy alta probabilidad, virus o
bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas o
hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado.

Se basa en los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN,

para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas
alternadas para separar las hebras de ADN recin formadas
entre s tras cada fase de replicacin y, a continuacin, dejar
que vuelvan a unirse las polimerasas para que vuelvan a
duplicarlas.
 Componentes de la PCR
Termociclador.
ADN molde, que contiene la regin de ADN que se va
a amplificar.
ADN polimerasa o mezcla de distintas. Adems, como
cofactores de la polimerasa.
Dos cebadores o iniciadores (en ingls, primers),
oligonucletidos.
Nucletidos libres: las enzimas DNA polimerasas van a
crear una cadena complementaria a la cadena molde
mediante la incorporacin de nucletidos al extremo 3
libre del cebador que se ha unido a la cadena molde.
Los nucletidos se aaden en forma de
desoxirribonuclesidos trifosfato (dNTPs).
 Ciclo de amplificacin
1-.Desnaturalizacin
2-.Hibridacin o unin del cebador
3-.Elongacin de la cadena
Elongacin final
 PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)
Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como
molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa
inversa para realizar la sntesis de un ADN
complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el
desarrollo inicial de una RT-PCR sera:
1er paso: retrotranscripcin a partir del ARN.
2 paso: amplificacin a partir de la primera hebra
de ADNc.
3er paso: PCR estndar.
Por lo general, la PCR es una tcnica comn y
normalmente indispensable en laboratorios de
investigacin mdica y biolgica para una gran
variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la
clonacin de ADN para la secuenciacin, la filogenia
basada en ADN, el anlisis funcional de genes, el
diagnstico de trastornos hereditarios, la identificacin
de huellas genticas (usada en tcnicas forenses y test
de paternidad) y la deteccin y diagnstico de
enfermedades infecciosas.
HIBRIDACIN FLUORESCENTE IN SITU
(en ingls FISH)
Es una tcnica de marcaje de cromosomas mediante la cual
estos son hibridados con sondas que emiten fluorescencia y
permiten la visualizacin, distincin y estudio de los
cromosomas as como de las anomalas que puedan
presentar. Utiliza molculas fluorescentes para localizar genes
o fragmentos de DNA. Esta tcnica es especialmente til para
mapear genes o localizar anormalidades cromosmicas.
Esta tcnica permite la rpida determinacin de aneuploidas,
microdeleciones, duplicaciones, inversiones.18
Los cromosomas que son usualmente analizados por FISH son
los 13, 18, 21, X e Y, que son los ms propensos a sufrir
anomalas. Estn relacionados a enfermedades como
el sndrome de Patau (13), el sndrome de Edwards (18),
el sndrome de Down (21), el sndrome de Turner (X) y
el sndrome del superhombre (Y).
 La FISH utiliza tres tipos de sonda:
Sondas especficas de un locus: estas sondas se hibridan a una regin
particular de un gen.
Sondas centromricas: son sondas que contienen secuencias
complementarias de las secuencias repetidas que se encuentran en los
centrmeros de los cromosomas.
Sondas para cromosomas completos: son colecciones de sondas de un
tamao reducido, cada una de las cuales se hibrida a una secuencia
diferente a lo largo de todo un cromosoma.
El procedimiento FISH:
 El procedimiento del FISH
1-. LA FIJACION Y LA PERMEABILIZACIN:

2-. LA HIBRIDACIN
3-. LAVADO 4-. VISUALIZACIN
4-. VISUALIZACIN
 Multicolor FISH

En el FISH multicolor, M-FISH o SKY

(Spectral Karyotiping) es una adaptacin
del FISH que permite la visualizacin de
los 23 pares de cromosomas a la vez,
teidos con diferentes sondas
fluorescentes, las cuales luego de
hibridarse con las secuencias de la
muestra, son identificadas con diferentes
colores fluorescentes. Esta es una tcnica
eficaz para buscar anomalas
cromosmicas, presenta la ventaja de
permitir pueden evaluar mltiples sitios
cromosmicos.
HIBRIDACIN IN-SITU CROMOGNICA
Es una tcnica en la que una hebra de ADN o ARN complementaria se usa
para localizar un ADN o ARN especfico en una muestra de tejido.
La metodologa puede ser utilizada para evaluar amplificacin de genes,
delecin de genes, translocaciones cromosmicas y nmero
de cromosomas. Es muy parecido a la tcnica FISH, concuerda 86%-96%
con el FISH, pero en este caso se usa una sonda de color visible y no
fluorescente, como es el caso del FISH. Por eso tiene la ventaja de ser ms
barata, ya que slo requiere un microscopio de campo claro y no necesita
fluorescencia.
Esta tcnica adems de proporcionar una alternativa econmica fcil de
usar para FISH, presenta la ventaja de que permite la visualizacin del
tejido, incluyendo el ncleo y forma de la clula.
SOUTHERN BLOT
Es un mtodo de biologa molecular que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla
compleja de este cido nucleico. Para ello, emplea la tcnica de electroforesis en gel de agarosa.
1. Extraccin del ADN
2. Digestin del ADN con una endonucleasa de restriccin
Es una enzima que corta el ADN bicatenario en donde tenga una secuencia caracterstica. La enzima que se
usa ms frecuentemente para el anlisis legal es HaeIII.
3-. ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

4-. PREPARACION DEL ENSAYO SOUTHERN

 5-. HIBRIDACION DE LA SONDA RADIOACTIVA

6-. DETECCION MEDIANTE AUTORRADIOGRAFA

GRACIAS