Ivn Felipe Vidal M

Estudiante Maestra en Bioqumica

Universidad Nacional de Colombia
 George Church David W. Deamer Daniel Branton
Profesor de gentica Profesor Investigador de Ingeniera Profesor Emerito
en la Escuela Mdica Biomolecular en la University of The Nanopore Group
de Harvard California, Santa Cruz at Harvard
 El sistema de secuenciacin
por nanoporo es apto para
detectar la interaccin T-Hg-T?
Muestras de DNA
Se sintetizaron oligonucletidos, target
y sondas, y se purificaron por HPLC.

Se disolvieron en agua dd hasta

1 mM y se almacenaron a -20C.

Mezcla y calentamiento
a 90C durante 5 min.

Enfriamiento gradual a T amb., y

se almacen a 4 C hasta su uso.
 Orificio de 150 mm en el centro de una
pelcula de Tefln de 25 mm de espesor.
Registro elctrico del Nanoporo

Target, sonda y
soluciones de HgCl2

1,2-diphytanoylglycerophosphatidylcholine

KCl y buffer Tris 10 mM

(pH 8,0) a 22 2 C.

La corriente amplificada,
filtrada y anlisis de datos.
Resultados
Los puentes de T-Hg-T funcionan como un bloqueo de interconexin, o
MercuLock, que estabiliza en gran medida la hibridacin de dsDNA. El
registro nanopore resultante para MercuLock puede discriminar T-T no
emparejados individuales en un dsDNA.
El sistema de secuenciacin por
nanoporo puede discriminar
metilnucletidos?
Muestras de DNA
Se sintetizaron oligonucletidos, target
y sondas, y se purificaron por HPLC.

Se disolvieron en agua dd hasta

1 mM y se almacenaron a -20C.

Mezcla y calentamiento
a 90C durante 5 min.

Enfriamiento gradual a T amb., y

se almacen a 4 C hasta su uso.
Conversin con Bisulfito
600 l M-
binding buffer

10 L de muestra
de target (1 mM)

10 L agua y 130 L
reactivo de conversin
Zymo-spin ICTM columna

98 C x 10 min y 64C x 2.5 h

Oligos eluidos
200 l buffer de
desulfonacin
10,000 x g por 30 s

Lavado 100 l buffer.

10,000 x g por 30s y Incubado a T. amb x 10,000 x g por 30 s

lavado (x2) 1520 min
Resultados
En general, las bases simples de uracilo y 5-metilcitosina pueden ser
discriminadas mediante la identificacin de la formacin MercuLock en el
nanoporo. Dado que el uracilo se convierte a partir de citosina no metilada,
en principio la citosina no metilada puede distinguirse de la 5-metilcitosina
en la secuencia de ADN original.
 El sistema de deteccin por
nanoporo discrimina metilaciones en
fragmentos de gen?
Muestras de DNA
Se sintetizaron oligonucletidos, target
y sondas, y se purificaron por HPLC.

Se disolvieron en agua dd hasta

1 mM y se almacenaron a -20C.

Mezcla y calentamiento
a 90C durante 5 min.

Enfriamiento gradual a T amb., y

se almacen a 4 C hasta su uso.
Resultados
El sistema es capaz de discriminar citosinas metiladas en sitios especficos,
adems detecta diferentes nmeros y distribucin de las mismas en
fragmentos de DNA.
Conclusiones
El reconocimiento de una sola molcula de la formacin MercuLock es rpido
y especfico, por lo tanto, puede tener potencial en la deteccin de
biomarcadores de metilacin para el diagnstico.

Proporciona una herramienta biofsica para explorar las interacciones entre

los iones metlicos y los cidos nucleicos en los organismos vivos y humanos.
Adems abre una va para la aplicacin de las interacciones metal-in-cido
nucleico en la deteccin rpida de la alteracin de un solo nucletido en la
secuencia gnica.