INSTRUMENTASI

HPLC KELOMPOK
C I T R A H A N D AYA N I
F AT H U L L A H D H YA M U T I A R A
JIHAN VIRDIANTI PUTRI
P U T R I L E S TA R I
R A E S A TA R T I L L A
 HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY)
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut dengan
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal
tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk
analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik.
Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair cair yang dapat digunakan baikuntuk
keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC
didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan
dengan luas atau area larutan standar.
PRINSIP KERJA HPLC

Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan senyawa-
senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase stasioner (diam).
Fase mobilenya adalah sampel dan eluen yang bercampur, dan fase stasionernya adalah silika gel
yang mengandung hidrokarbon. Sehingga senyawa yang memiliki kepolaran yang lebih tinggi
akan tertahan pada fase stasioner yang bersifat polar.
Metode pemisahan umum dalam HPLC tergantung sifat polaritas senyawa dalam eluen
 2 JENIS FASE DALAM HPLC

Fasa Normal Fasa Terbalik

Fasa gerak Fasa gerak polar

nonpolar Fasa diam
Fasa diam polar nonpolar
BAGIAN-BAGIAN DARI HPLC
1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium
dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1
sampai 2 liter pelarut. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.

2. Pompa
Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu pompa kinerja konstan (constant pressure) dan pompa
pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu:
pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut
teratur (pulsating), oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk,
menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran.
3. Tempat penyuntikan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan
disuntikkan secara langsung ke
dalam fase gerak yang mengalir di
bawah tekanan menuju kolom
menggunakan alat penyuntik yang
terbuat dari tembaga tahan karat
dan katup teflon yang dilengkapi
dengan keluk sampel (sample
loop) internal atau eksternal.
4. Kolom dan Fase diam
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan
bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak
dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit
asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan.
Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus
fungsional yang lain. Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang,
maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar.
5. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu
mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor
indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan
mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia.
 JOURNAL OF HPLC (HIGH PERFORMANCE
LIQUID CHROMATOGRAPHY)
VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR ASIKLOVIR DALAM
SEDIAAN SALEP MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR
KINERJA TINGGI (KCKT)

VALIDASI METODE ANALISIS KROMATOGRAFI CAIR

KINERJA TINGGI UNTUK PENETAPAN KADAR AMOXICILIN
DALAM PLASMA SECARA IN VITRO

VALIDASI METODE HPLC UNTUK PENETAPAN ASPIRIN DAN

ASAM SALISILAT DALAM PLASMA KELINCI (LEPUS
CURPAEUMS) SECARA SIMULTAN
A. FASE GERAK
1. Asetonitril:asam fosfat (80:20 v/v)
2. Methanol: buffer kalium dihidrogen fosfat (10:90 v/v), pH 5
3. asetonitril : dapar fosfat 20 mM pH 2,5 (30:70 v/v)

B. FASE DIAM
1. Kolom oktadesil silika (ODS atau C18)
2. Kolom symmetry C18 (15 cm x 4,6 mm, 5 m)
3. Kolom Purospher Star RP-18 Endcapped (250 x 4,6 mm i.d., 5 m)

C. DETECTOR
1. Detektor uv-visibel 230 dan 254 nm
D. FAKTOR YANG MEMPENGARUHI PARAMETER KROMATOGRAFI
1. Pemilihan komposisi fase gerak dan kolom yang sesuai
2. Preparasi yang tepat
3. validasi metode analisis yang diusulkan.
E. PREPARASI SAMPEL
1. Penetapan kadar asiklovir dalam salep
Proses ekstrasi dilakukan dengan cara Asiklovir ditimbang sebanyak1gram, kemudian
dilarutkan dengan 50 ml aquabidest suasana asam HCl. Lalu dipanaskan larutan dalam
tabung reaksi selama beberapa menit, setelah itu dibekukan dengan es. Untuk
memisahkan zat maka disentrifugasi pada30 rpm selama 15 menit. Disaring masing-
masing dengan membrane filter 0,45 m. Kemudian larutan sampel diambil 1 ml
diarutkan dengan fase gerak sebanyak 50 ml. Sampel dianalisis dengan menggunakan
KCKT dengan fase gerak asetonitril:asam fosfat (80:20 v/v) dan fase diam C18. Detektor
diatur pada panjang gelombang 254 nm. Sebanyak 20 L diinjeksikan dengan kecepatan
alir 1 mL/menit. Penetapan kadar sampel dilakukan sebanyak 6 kali pengulangan untuk
salep sampel. Dihitung kadar Asiklovir dengan mensubstitusikan luas area sampel Y
kedalam persamaan regresi linier y=bx+a (Ravisankar, et al 2015 dan Ghosh, et al, 2012).
2. Penetapan Kadar Amoxicilin dalam plasma Darah Pengambilan sampel darah
Darah diperoleh dari pengambilan darah peneliti sebanyak 12 mL. Darah tersebut diambil
menggunakan dispo 12 mL. Darah kemudian dimasukkan de dalam tabung yang sudah berisi
larutan EDTA.

Sebelum penetapan kadar amoxicilin dalam plasma, dilakukan spaiking sampel yaitu
dengan cara pengukur larutan induk amoxicilin 500 g/mL ke dalam sistem KCKT.
Sebanyak 0,5 mL darah yang diambil dari sampel pada tabung EDTA di masukkan ke dalam
tabung sentrifuge + Pelarut Organik ( Metanol) sebanyak 0,7 mL divorteks 30 detik, kemudian
disentrifugasi selama 10 menit pada 3000 rpm. Kemudian Alikuot disaring , diambil supernatan
(plasma) lalu supernatan diinjeksi sebanyak 20 L ke alat KCKT. Dianalisis kromatogram untuk
mengetahui kondisi kromatogram blanko darah.
3. Penetapan kadar aspirin dan asam salisilat dalam plasma
Sampel darah kelinci dipreparasi sebagaimana prosedur penyiapan plasma. Tidak lebih dari 60
menit, plasma segera diekstraksi sesuai prosedur penetapan kurva baku. Sampel disimpan dalam
freezer padasuhu -40C. Tidak lebih dari 12 jam setelah penyimpanan, sampel beku dicairkan
 TAHAPAN METODE ANALISIS
KROMATOGRAFI
1. Pembuatan larutan baku
2. Penentuan panjang gelombang
3. Pembuatan fase gerak
4. Optimasi fase gerak
5. Pembuatan kurva baku
6. Validasi metode analisis
7. Penetapan kadar
DANK U WELL!