Centrifugarea si

ultracentrifugarea
 =operatia de separare a unor componente aflate
intr-o suspensie, intr-un lichid sau fluid uniform
Factori care influenteaza centrifugarea:
Masa moleculara
Greutatea specifica
Forma particulei
Diferenta de greutte specifica dintre particulele
suspendate si fluid
Viteza unghiulara
 In centrifugare energia cinetica a particulelor
se transforma in caldura si energie potentiala
la atingerea acestora de peretii vaselor in care
se realizeaza centrifugarea
In procesul de centrifugare se obtin alaturi de
sediment si limpedele=faza
uniforma=supernatantul
 Viteza unghiulara determina timpul de
centrifugare
Maxim 10000 rotatii per minut pentru eritrocite
Centrifugarea sub:
Unghi fix: se depune pe peretii laterali la o inaltime
dependenta de unghi ( de obicei 30 grade) ->
sedimentul se depune asimetric pe fundul eprubetei
Unghi variabil: se depune datorita fortii centrifuge
 Probele vor ocupa pozitii dependente de viteza
unghiulara: sedimentul peste o anuita valoare
determina asezarea orizontala: sedimentul se
depune la partea inferioara a eprubetei de
centrifugare
Rotorul: confectionat din material foarte dur, cu
densitate foarte mare
Orice defectiune in turnarea materialului sau in
variabilitatea compozitiei determina dezechilibrul
rotorului in timpul functionarii ce duce la ruperea
axului de rotatie
 Rotorul: simetric!
Probele se introduc simetric in rotor si
cantarite astfel incat sa nu modifice modul de
rotire a probelor
In centrifugile obisnuite care au sspre
20000RPM, nu se realizeaza vidarea sau
racirea rotorului si nici a incintei
 Intre 20-25000 RPM se impune racirea
incintei in care se realizeaza miscarea pentru
diminuarea efectului termic rezultat la
frecarea dintre aer si rotor
Peste 25000 RPM= ultracentrifugare: incinta
se videaza si se raceste pentru diminuarea
efectului termic
 Centrifugarea simpla

Intr-o centrifuga simpla se urmareste

depunerea unei anumite categorii de particule
ca sediment in timp ce restul particulelor
raman in solutie
Se poate utiliza orice tip de rotor si in funcie
de dimensiunile particulelor ce se doresc a fi
separate, tipul de centrifuga
 Probele se introduc in tuburile de centrifuga
Echilibrarea probelor
Inchiderea etansa a tuburilor de centrifug
Pentru un anumit tip de particula,
sedimentarea se poate face in doua moduri:
-stationar: cand se lucreaza timp
indelungat la o intensitate de camp mai mica
Dinamic: cand separarea se face timp scurt la
turatie mare
 Colectarea fractiilor
Supernatantul se separa prin decantare simpla
 Elemente de spectrofotometrie
Tehnicile de spectrofotometrie permit
determinarea concentratiilor unor substante
prin masurarea gradului in care acele
substante absorb o radiatie luminoasa de o
anumita lungime de unde (vizibil/ UV)
Cele mai usor accesibile sunt determinarile in
domeniul VIS
Se pot efectua determinari experimentale si in
domeniul UV apropiat
 Spectrofotometrie si colorimetrie
colorimetrul=aparat ce permite masurarea
gradului in care anumite lungimi de unde
apartinand domeniului vizivil sunt absorbite
de o proba lichida
Spectrofotometrele permit efectuarea de
determinari nu doar la lungimi de unda din
domeniul visibil, ci si in domeniul UV apropiat
 Schema de principiu de functionare a
spectrofotometrului presupune existenta:
1. Sursa de radiatii
-lampa care emita in VIS
Spectrofotometrele sunt dotate cu 2 lampi (VIS-UV)
folosite in functie de domeniul spectral la care se
lucreaza la un moment dat
Spectrul sursei de lumina reprezinta variatia
intenstiatii emisiei lampii in functie de lungimea de
unda
 Din cauza ca la lungimi diferite de unde,
lumina este emisa cu intensitate diferita, este
necesarea reetalonarea aparatului ori de cate
ori se va modifica lungimea de unda
2. Fanta: permite reglarea cantitatii de lumina ce
strabate proba
La deschideri mici ale fantei va trece mai putina
lumina, sensibilitatea determinarii va fi mai mare
3. Monocromatorul: are rolul de a separa
lungimile de unda ale radiatiei luminoase de la
lampa
 4. Proba este adusa in calea luminii intr-o
cuvita confectionata din sticla in cazul
determinarii in visibil si respectiv din cuart
pentru UV
-Grosimea cuvitei este inscriptionata pe
cuvita respectiva
5. Detectorul de radiatii: este cel mai des
utilizata o fotocelula capabila sa masoare
intensitatea luminiii ce trece prin proba
 6. Sistemul de amplificare: este un sistem electronic
capabil sa tranforme semnalul electric al detectorului
intr-un semnal afisabil
Fiind aparat electric, spectrofotometrul prezinta un
zgomot de fond ce trebuie compensat prin reglarea
apratului astfel incat indicatia acestuia sa fie 0 in
absenta oricarei lumini emise.
Se realizeaza zeroul electric al aparatului in
momentul in care aparatul este deschis, cand va intra
un fascicul de lumina emergent cu intenstitatea= 0
 Componentele probei vor absorbi o parte din acest
fascicul astfel incat la iesirea din proba a fasciculului
emergent va avea o intensitate I<I0
Pentru fiecare determinare se va prepara o proba sau
blanc ce contine toate substantele din proba de
analizat, mai putin cea a carei absorbtie se masoara
Intensitatea radiatiei luminoase ce a strabatut proba
blanc va reprezenta intensitatea in raport cu care se
determina extinctia probei
 Aparatul va fi etalonat astfel incat sa indice valoarea
0 pentru extinctie 100%=> zero optic
Extinctia unei probe este direct proportionala cu
concentratia probei si cu grosimea cuvitei strabatuta
de fasciculul de lumina
Legea Lambert-Beer: E=ecl
e-coef de absorbtie
Cand concentratia probei este exprimata in moli, iar
grosimea cuvei in cm, coeficientul de absorvtie este
coeficientul molar de absorbtie
 e=M-1*cm-1

Determinarea concentratiei folosind standardul

intern ( solutie ce contine aceleasi substante ca si
proba fiind supusa acelorasi operatii si a carei
concentratie este cunoscuta
Es=elcs
Ep=elcp
Es/Ep=cs/cp
Cp=cs*Ep/Es
Cs=7.5g/100mL
 Determinarea concentratiei folosind curba etalon
Curba etalon se obtine prin reprezentarea grafica a
valorilor extinctiilor obtinute pentru o serie de dilutii
diferite ale probei de determinat
Se utilizeaza cand nu este accesibil un standard
intern
Reprezentarea grafica a extinctiilor in functie de
concentratii duce la obtinerea unei drepte ce trece
prin origine
 Dozarea proteinelor totale
Principiul metodei: ionul de cupru formeaza
cu atomi de azot componenti ai legaturii
peptidice la valori de pH alcalin un ion comple
ce poate fi dozat prin masurarea extinctiei sale
la 545nm
Se regleaza fata de blanc- se realizeaza
determinarea spectrala la 545 nm
Estd= val cunoscuta pt cstd=7,5g/100mL
Eproba=valoare x pt cp=?
 Interpretarea rezultatelor
Valori normale ale proteinelor totale serice:
6,5-8,2g/100 mL
Albumine: 4,5-5,5g/100mL
Globuline: 1,5-3,4 g/100mL
Hipoproteinemia
Se intalneste in hiperhidratare, inanitie, afectiuni renale, hepatice
Albuminele scad in hiperhidratare, globulinele scad in inanitie
Hiperproteinemia
Albuminele cresc in hipohidratare, globulinele cresc in infectie pe seama
cresterii excedentare a lanturilor grele
 Titrarea electrometrica a alaninei
cu NaOH
Mod de lucru
Intr-un pahar Berzelius se amesteca 10mL solutie
alanina 0,1M cu 5 mL sol HCl 0,1M si 1-2 picaturi de
fenoftaleina
Se adauga sub agitare NaOH peste solutia de alanina
din pahar urmarindu-se variatia de pH/8
cationamfion pIanion
Se obtin doua paliere la reprezentarea grafica a
titrarii!