Asistensi Praktikum

Biokimia Analitik
SDS-PAGE
 Urutan Kerja
1. Preparasi sampel
Mencampur sampel protein dengan SDW dan
sampel buffer sesuai petunjuk.
Sampel protein di panaskan 5 menit
2. Demo pemasangan gel. Sampel protein
didinginkan di kulkas.
3. Memasukkan sampel protein ke gel
4. Running alat elektroforesis (60-90 menit)
5. Asistensi
6. Staining 30 menit (pengecekan log book)
7. Destaining sampai jernih
 SDS-PAGE
(= sodium dodecylsulphate-polyacrylamide
gel electrophoresis)

Metode untuk memisahkan protein

berdasarkan berat molekul dan perbedaan
muatan.
Mengapa menggunakan Acrylamide Gels untuk
pemisahan Protein?

Acrylamide gel: tight matrix

Ideal for protein separation
Smaller pore size than agarose
Proteins much smaller than intact
chromosonal DNA

average amino acid = 110 Da

 Levels of Protein Organization
Primary structure = linear chain of
amino acids

Secondary structure = domains of

repeating structures, such as -
pleated
sheets and -helices

Tertiary structure = 3-dimensional

shape of a folded polypeptide,
maintained by disulfide bonds,
electrostatic interactions, hydrophobic
effects

Quaternary structure = several

polypeptide chains associated
together to form a functional protein
 -protein didenaturasi dengan
memanaskannya di sampel buffer
yang mengandung sodium dodecyl
sulphate (SDS)

-sehingga protein tidak lagi

mempunya struktur sekunder,
tersier maupun kuartener
 -sampel protein yang akan dirunning
adalah protein dengan bentuk seperti tali
dan mempunyai muatan yang sama
(negatif)
 How does an SDS-PAGE gel
work?
Negatively charged proteins
move to positive electrode
s-s

SDS, heat
Smaller proteins move
faster proteins with
SDS

Proteins separate by size

+
METODE
SDS-PAGE
Bahan yang digunakan
1. Resolving buffer 4 x /IB/lower tris pH 8,8
Tris 18,166 g di adjust pH hingga 8,8
SDS 0,4 g
Akuades fill up hingga 100 mL

2. Stacking buffer 4 x /IIB/ upper tris pH 6,8

Tris-HCl 6,056 g
SDS 0,4 g
Akuades fill up hingga 100 mL

3. Gel akrilamid 12%

a. Akrilamid 30%
30% akrilamid = 1,2 g
0,8 % bis akrilamid = 0,032 g
Akuades 4 mL
 b. Resolving gel 12 %
30% akrilamid 4 mL
d-H2O 4 mL
IB Solution mL
Temed 5 L
25 % APS 25 L

c. Stacking gel 4%
30% akrilamid 0,65 mL
d-H2O 3,35 mL
IIB solution 1 mL
Temed 10 L
25% APS 25 L

4. Sampel buffer 5x
3,9 mL akuades steril
1,0 mL 0,5 Tris pH 6,8
0,8 mL glycerol
1,6 mL 10 % SDS
0,4 mL 2-mercaptoethanol
0,4 mL 1% bromphenol blue
5. Running buffer 5x
Tris 7,575 g
Glicine 36,05 g
SDS 2,5 g
Akuades fill up 200 mL

6. Gel stain Commasie Blue

Metanol 40 mL
Asam asetat glacial 10 mL
Akuades 50 mL
Commasie blue 0,1 g

7. Gel destain
Metanol 40 mL
Asam asetat glacial 10 mL
Akuades 50 mL
Vol sampel Protein (L) :

Kons yang diinginkan (g) x 1000

Kons yang diketahui (g/mL)

Volume 5x sampel buffer = 1/5 x total volume

Total volume per well 15 L
SDW total volume (vol sampel + vol
sampel buffer)
 Preparasi Sampel
Tabel 1. Preparasi sampel untuk konsentrasi 10
dan 15 g/lane
Konsentrasi Volume protein yang Sampel Volume total
Kelompok Well Sampel SDW (l)
loading (g/lane) diambil dari stok (l) buffer (l) loading (l)

1 1 Marker - 5 - - 5

1 2 Kontrol Sel Vero 10 11.0 1.0 3 15

2 3 Kontrol Sel WiDr 10 8.9 3.1 3 15

3 4 Kontrol Sel WiDr 15 13.4 - 1.6 15

4 5 Perlakuan 12 Jam Ulangan 2 10 7.8 4.2 3 15

5 6 Perlakuan 12 Jam Ulangan 2 15 11.7 0.3 3 15

6 7 Perlakuan 12 Jam Ulangan 1 15 11.6 0.4 3 15

7 8 Marker - 5 - - 5

7 9 Perlakuan 24 Jam Ulangan 1 10 9.5 2.5 3 15

8 10 Perlakuan 24 Jam Ulangan 2 10 9.9 2.1 3 15

9 11 Perlakuan 24 Jam Ulangan 2 15 14.5 - 0.5 15

10 12 Perlakuan 36 Jam Ulangan 2 10 10.6 1.4 3 15

Cara Kerja

Didingin
Dipanaskan kan Loading
Preparasi 95 C dalam sampel
sampel selama 5 kulkas 4C dalam
menit 10-15 sumuran
menit
 Membuat Gel Poliakrilamid

Glass plates dibersihkan Pemasangan karet Glass plates di jepit

dengan tisu dan alkohol 70% pada short glass dengan penjepit

Pemberian tanda 1 cm di Akuades selanjutnya di Plates diuji dengan akuades

bawah comb sebagai batas serap menggunakan untuk mengetahui kebocoran
resolving gel paper towl / tisu makan
 Setelah dipastikan tidak bocor, resolving gel
dimasukkan sampai batas marker. Diberi akuades
untuk menghilangkan gelembung

Ditunggu menjendal 20-40 menit, kemudian

masukkan stacking gel

Segera setelah stacking gel dimasukkan, sisir/comb

dimasukkan untuk mencetak sumuran

Ditunggu menjendal 5-10 menit

Preparasi Alat SDS-PAGE
Gel yang sudah menjendal, dilepas karet
dan penjepit

Bagian short plate diletakkan

menghadap inner chamber

Loading sampel menggunakan pipet

belalai

Proses running pada 100 V sampai selesai

Setelah proses running selesai, gel diambil
perlahan dengan solet khusus

Stacking gel dibuang

Staining selama 30 menit

Destaining sampai gel jernih

Hasil Praktikum 2016
Perhitungan
Dicari nilai Rf dan molekul protein marker
Didapatkan nilai R
Log MW sebagai fungsi x dan Rf sebagai fungsi
y
Didapatkan nilai molecul weight hasil dari
antilog molecul weight
Tabel 1. Nilai Rf dan Log molekul protein marker
Contoh....
Tracking dye front : 9 cm Tabel 2. Nilai Rf dan Log berat molekul protein sampel

Jarak migrasi Jarak migrasi

BM (D) Log BM Rf Pita Rf Log BM BM (D)
pita (cm)
pita (cm)
175000 5,243038049 0,5 0,055
1 1.5 .... .... ....
80000 4,903089987 2,3 0,255
58000 4,763427994 3,2 0,355 2 1.7 .... .... ....
46000 4,662757832 3,8 0,422 3 2.3 ..,. .... ....
30000 4,477121255 5 0,555
4 3 0,33 4,80882 64390,23
25000 4,397940009 5,4 0,600
17000 4,230448921 6,4 0,711 5 4 0,44 4,63876 43527,126
7000 3,84509804 8,5 0,944 6 4.4 .... .... ....
7 5.6 .... .... ....
8 5.9 .... .... ....
6.000000000
9 7 .... .... ....
y = -1.5463x + 5.3186
5.000000000
R = 0.999 10 7.5 .... .... ....
4.000000000
Log BM

3.000000000
Series1
2.000000000 Linear (Series1)
.....Contoh
1.000000000 ......ubah menjadi kD Rf 0,33 = 64,39 kD
Rf 0,44 = 43,53 kD
0.000000000
0.0000.2000.4000.6000.8001.000
Rf

Kurva persamaan linier dari protein marker

 Hasil
Klp Well Sampel Hasil separasi RF
(jumlah pita)
0,05; 0,09; 0,16; 0,22; 0,29; 0,38; 0,45; 0,55;
1 1 Marker 10
0,76; 0,94
0.18; 0.2; 0,23; 0,25; 0,31; 0,32; 0,36; 0,42;
1 2 Kontrol Sel Vero 11
0,44; 0,47; 0,53
0,16; 0,18; 0,23; 0,25; 0,31; 0,35; 0,36
2 3 Kontrol Sel WiDr 7

0,16; 0,18; 0,2; 0,22; 0,27; 0,31; 0,35; 0,36;

3 4 Kontrol Sel WiDr 10
0,45; 0,55

4 5 Perlakuan 12 Jam Ulangan 2 3 0,22; 0,25; 0,36

5 6 Perlakuan 12 Jam Ulangan 2 3 0,2; 0,27; 0,36

0,2; 0,27; 0,35; 0,36; 0,45

6 7 Perlakuan 12 Jam Ulangan 1 5

7 8 Marker 10

7 9 Perlakuan 24 Jam Ulangan 1 4 0,2; 0,25; 0,35; 0,36

8 10 Perlakuan 24 Jam Ulangan 2 4 0,18; 0,2; 0,27; 0,29

9 11 Perlakuan 24 Jam Ulangan 2 7 0,16; 0,2; 0,29; 0,31; 0,35; 0,36; 0,45

10 12 Perlakuan 36 Jam Ulangan 2 4 0,2; 0,25; 0,27; 0,29

Hasil Praktikum 2017
Hasil Praktikum 2017
skema pita
Poin-poin Pembahasan
1. Prinsip kerja dan fungsi SDS-PAGE
2. Fungsi dan tujuan dari setiap bahan dan
prosedur kerja
3. Faktor-faktor yang berpengaruh dalam
migrasi sampel
4. Pembahasan hasil pratikum. Protein yang
diharapkan adalah caspase dan procaspase.
Apakah pitanya muncul?
TERIMA KASIH