KROMATOGRAFI

KERTAS
Prinsip dan Cara Kerja
Kromatografi Kertas
 Definisi

 Kromatografi kertas merupakan salah satu bentuk

pemisahan zat secara sederhana, biasanya digunakan

untuk uji secara kualitatif.

 Termasuk kromatografi planar yang menggunakan

kertas sebagai penyangga fase diam dengan

mekanisme pemisahan partisi yang dominan.
 Prinsip Kromatografi Kertas

 Prinsip: partisi multiplikasi suatu senyawa antara

dua cairan tak bercampur.
 Pada kromatografi kertas, fase bawah berupa air
atau pelarut yang mengandung air, terikat secara
stasioner pada selulosa kertas. Jadi partisi suatu
senyawa terjadi antara selulosa-air dan fase cair yang
melewatinya, yaitu berupa pelarut organik yang
sudah dijenuhkan dengan air atau fase pelarutnya.
 Senyawa yang dapat dipisahkan dengan
Kromatografi Kertas

Golongan senyawa yang sifatnya sangat hidrofil:

1. Gula
2. Alkohol polivalen
3. Asam alfa amino
4. Fenol dan asam fenilkarboksilat
5. Asam organik alifatik
6. Glikosida
7. Zat anorganik (kation)
 Kertas Kromatografi

 Berupa selulosa murni dengan serabut panjang yang dalam

keadaan menggelembung bersama-sama dengan air atau pelarut

yang mengandung air merupakan fase diam atau melampaui
impregnasi dengan senyawa lipofilik dapat bertindak sebagai
bahan pengembang.

 Kemurnian, kehomogenan, kemampuan menyerap, dan

ketangguhan merupakan faktor penentu.

 Kapasitas dan lamanya kromatografi tergantung dari ketebalan

dan kemampuan menyerap atau kemampuan menggelembung

kertas.
 lanjutan

 Besarnya lembar kertas tergantung dari bejana

pengembangan dan juga beberapa noda senyawa

yang akan ditotolkan. Sifat dapat memisahkan kertas
dapat diubah dengan impregnasi.

 Impregnasi dilakukan dengan mencelup atau

mengembangkan kertas dengan suatu larutan
tertentu atau dengan penyemprotan.
 Kertas Saring Whatmann

 No.1 : Untuk berbagai aplikasi laboratorium; cairan yang

jernih, filtrasi gas, analisis polusi udara dan analisis
tanah.
 No.1 PS Repellent : sebagai pemisah fase cepat di tempat
saluran pemisah konvensional. Kertas mempertahankan
fase berair dan melewati fase hidrofobik
 No.1 khusus kromatografi : Khusus dibuat untuk
kromatografi. Putih, halus permukaan, normal-
keras. Direkomendasikan untuk penggunaan
kromatografi tujuan umum
 lanjutan
 No.2 : Agak lebih kuat, lebih lambat dan lebih menyerap
daripada kelas No.1. Untuk keperluan umum aplikasi
laboratorium, pemantauan kontaminan tertentu di atmosfer,
dan pengujian tanah
 No.3 : Sedikit berbutir permukaan. Cukup tebal. Daya serap
tinggi. . Sangat cocok untuk digunakan dalam saluran
Buchner
 No.4 : Untuk penyaringan yang cepat dengan retensi yang
sangat baik dari partikel kasar dan agar-agar presipitat. Baik
cepat filter untuk pembersihan rutin cairan biologis atau
ekstrak organik selama analisis. Juga untuk pemantauan
polusi udara di mana tingkat aliran tinggi diperlukan.
 lanjutan
 No.5 : Sangat berguna untuk menjernihkan cairan keruh. Banyak
digunakan dalam analisis air.
 No.41 : Untuk prosedur analitis yang melibatkan partikel kasar
atau presipitat agar-agar. Berguna untuk besi atau aluminium
hidroksida. Juga digunakan dalam analisis kuantitatif polusi
udara sebagai pita kertas ketika menentukan senyawa gas pada
aliran tinggi.
 No.44 : Ashless kertas untuk analisis gravimetri dengan retensi
partikel yang sangat halus.
 No.50 : Tipis, halus, keras, kertas abu rendah dengan kekuatan
basah yang tinggi. Mempertahankan kristal terbaik
presipitat. Sangat cocok untuk penyaringan kualitatif atau
kuantitatif membutuhkan bantuan vakum pada saluran Buchner
atau 3-bagian filter.
 No.54 : direkomendasikan untuk endapan agar-agar

dan partikel kasar.

 No.551 : dirancang untuk mendeteksi cahaya berwarna

dari endapan,digunakan di laboratorium makanan dan

dalam penentuan kotoran gas.

 No.589 : untuk pemantauan udara, analisis metalurgi,

serta kromatografi senyawa dengan nilai Rf yang benar

terpisah
 Sistem Pelarut/Fase Gerak

 Pelarut harus mudah diuapkan setelah proses eluasi,

dan tidak boleh meninggalkan sisa karena dapat
mengganggu pengamatan bercak.
 Idealnya, cairan fase gerak tidak boleh bercampur
dengan fase diam atau sebaliknya.
 Fase diam berupa pelarut polar, umumnya air, yang
akan terserap oleh serat selulosa kertas.
 Fase gerak dapat berupa alkohol, asam-asam, keton,
ester, amin, hidrokarbon, atau campuran pelarut
agar pemisahan sempurna.
 Contoh Pelarut

1. n-butil alkohol yang dijenuhkan dengan asam

klorida 3M.
2. Asetilaseton yang dijenuhkan dengan air.
3. Asam asetat glacial yang mengandung 25%
(v/v) metanol kering.
4. Aseton yang mengandung 5% (v/v) air dan
8% (v/v) asam klorida.
5. Piridina yang mengandung 20% (v/v) air dan
1%
 Mekanisme kerja

 Sebelum suatu senyawa dipisahkan dengan kromatografi

kertas, pertama-tama harus ditotolkan.
 Senyawa dilarutkan dalam pelarut sesuai dan ditotolkan
dengan mikropipet dalam bentuk titik atau bentuk garis.
 Konsentrasi larutan yang ditotolkan harus antara 1-5%.
Untuk penotolan berbentuk titik dibutuhkan volume 1-10
μl.
 Kepekaan sistem deteksi yang dipakai memiliki batas
terendah kuantitas cuplikan, yakni 1x10-4 sampai 1x10-8
 Makin kecil noda, makin besar ketajaman pemisahan
dan makin mudah menguap pelarut yang digunakan
untuk penotolan, makin kecil diameter noda.
 Sebelum senyawa ditotolkan, garis awal ditandai dengan

garis menggunakan pensil dan pada garis ini tandai

masing-masing titik awal.

 Untuk kromatografi menurun, garis awal dibuat dengan

jarak 15 cm dari tepi.

 Untuk kromatografi menaik, jarak ini diukur 4-5 cm.

 Jarak noda awal satu dengan yang lain sebaiknya 1-3 cm.
 Alat dan Bahan
 Alat
- bejana kromatografi
- rak tahan korosi
- bak pelarut
- batang kaca antisifon
- mikropipet
- penyemprot yang tahan terhadap pereaksi dan
menghasilkan semprotan berupa butir-butir halus
 Bahan :
- kertas kromatografi
- reagensia
- zat uji
- pelarut (eluen)
 Prinsip Kromatografi Partisi

Partisi merupakan proses sorpsi yang analog dengan

ekstraksi pelarut. Kromatografi ini sering disebut dengan
kromatografi fase terikat dimana fase diam cair diikatkan
pada padatan lapis tipis lemban (inert). Dalam partisi
yang sebenarnya solute akan terdistribusi di antara fase
gerak dan fase diam sesuai dengan kelarutan relatif di
antara keduanya.
 Jenis-jenis Kromatografi Kertas

1. Kromatografi Kertas Menaik

2. Kromatografi Kertas Menurun
3. Kromatografi Kertas Horizontal
Kromatografi kertas menaik
 Kromatografi Kertas Menaik

 Ujung bawah kertas dicelupkan ke dalam bejana

berisi fase gerak, sehingga memungkinkan fase gerak

merambat naik pada kertas.
Beberapa contoh ekstraksi dengan Kromatografi Kertas :
 uji kualitatif kandungan klorofil daun ini menggunakan
teknik kromatografi kertas yang
diwakili spesies Hibiscus rosa-sinensis.
 Daun tersebut dihaluskan dengan mortar serta dengan
penambahan sedikit demi sedikit alcohol 95 %.
 Ekstrak dari larutan ini akan terlihat berwarna hijau. Setelah
didapatkan ekstrak, ditunggu beberapa menit sampai
ampasnya mengendap.
 Uji kandungan klorofil dilakukan dengan kertas saring yang
digantungkan dengan penjepit pada benang yang telah
diikatkan ke statif. Ujung yang lain dari kertas saring tersebut
dicelupkan ke dalam larutan gerusan daun pada cawan petri.
Pengamatan dilakukan dengan melihat pigmen yang terserap
oleh kertas saring hingga penyerapannya konstan.
 Analisa senyawa golongan flavonoid herba Tempuyung
(Sonchus arvensis L.)
 Setelah didapatkan ekstrak, dilarutkan dalam
methanol kemudian disentrifuse untuk memisahkan
endapan.
 Filtrat jernih yang diperoleh ditotolkan hingga
membentuk pita pada bagian bawah kertas Whatman
no.2 ukuran 20x20 cm.
 Kertas dikembangkan dengan eluen campuran dari
butanol : asam asetat : air (4:1:5)
 Pemisahan ini menghasilkan 5 buah pita yang terpisah
secara jelas yang memberikan fluoresensi yang
berbeda-beda di bawah lampu UV.
Kromatografi kertas menurun
 Alat
 Bejana kromatografi bertutup kedap uap dan mempunyai lubang untuk
penambahan pelarut atau untuk pengurangan tekanan dalam bejana sebaiknya
dari kaca, baja tahan karat atau porselen, dan dirancang dapat dilakukan
pengamatan selama kromatografi berlangsung, tanpa membuka bejana.
 Rak tahan korosi yang lebih kurang 5 cm lebih rendah dari tinggi bejana bagian
dalam. Rak digunakan sebagai penyangga bak pelarut dan batang kaca antisifon,
yang menahan kertas kromatografi.
 Satu atau lebih bak pelarut terbuat dari kaca, yang dapat menampung sejumlah
pelarut lebih dari yang diperlukan untuk satu kali kromatografi. Panjang bak
pelarut harus lebih lebar darikertas kromatografi.
 Batang kaca antisifon ,yang disangga oleh rak, letaknya di luar sejajar dengan
dan sedikitlebih tinggi dengan tepi bak pelarut.
 Kertas kromatografi berupa kertas saring khusus, dengan lebar tidak kurang
dari 2,5 cm,tidak lebih lebar dari panjang bak pelarut dan dipotong lebih kurang
sama dengan tinggi bejana.Dibuat garis tipis dengan pensil melintang pada
kertas 'pada jarak tertentu dari salah satu ujungkertas, hingga jika kertas
digantung pada batang kaca antisifon, dengan ujung atas di dalam bak pelarut
dan ujung bawahnya tergantung bebas dalam bejana, garis tersebut terletak
beberapa cmdi bawah batang kaca antisifon. Usaha-kan agar kertas tidak
terkontaminasi dan tidak kotor
 Prosedur
 Zat dilarutkan dalam pelarut yang sesuai. Teteskan sejumlah volume larutan
yang mengandung I µg hingga 20 µg ditotolkan dengan pipet mikro pada titik-
titik tertentu pada garis pensil, diameter bercak 6 mm hingga 10 mm dengan
jarak antar bercak tidak kurangdari 3 cm.
 Jika jumlah larutan yang ditotolkan akan menghasilkan bercak dengan
diameter melebihi 6 mm hingga 10 mm; totolkan larutan sedikit demi sedikit
pada titik yang sama, tiapkali biarkan mengering dahulu sebelum ditotolkan
lagi.Kertas tersebut digantung dalam bejana dengan menggunakan batang kaca
antisifon yangmenahan ujung alas kertas dalam hak pelarut.
 Dasar bejana digenangi dengan sistem pelarut yang ditetapkan. Penjenuhan
bejana dapat dipercepat dengan cara melapis dinding bagian dalam bejana
dengan kertas saring yang dibasahi dengan sistem pelarut yang ditetapkan.
Bagian kertas yang tergantung di bawah batang kaca antisifon harus tergantung
bebas di dalam bejana tanpamenyentuh rak, dinding bejana atau cairan yang
terdapat dalam bejana. Bejana ditutup rapat,agar terjadi penjenuhan bejana dan
kertas dengan uap pelarut.
 Setelah jenuh, fase gerak dimasukkan ke dalam bak pelarut melalui lubang.
Lubang ditutup dan fase gerak dibiarkan merambat turun padakertas sejauh
yang dikehendaki. Pada waktu membuka tutup bejana dan mengangkat
kertas,usahakan agar pelarut tidakmerambat lagi. Batas rambat pelarut segera
ditandai dan kertasdikeringkan.
 Keuntungan dan kerugian

 Keuntungan : lebih cepat

 Kerugian : lebih sulit untuk memasang peralatannya.

 Cara deteksi bercak sampel

 Warna alamiah

 Fluorosensi

 Reaksi kimia, ketika kertas disemprot dengan reagen

ex: ninhidrin untuk identifikasi asam amino.

 Radioaktifitas
 identifikasi
 Dengan membandingkan nilai Rf sampel dengan
standart, secara kuantitatif dibuat kurva kalibrasi.
 Menggunting kertas yang mengandung bercak
sample, kemudin di eluasi dengan pelarut sesuai,
baru kemudian dianalisis.
 Parameter Kualitatif
1. Harga Rf : merupakan parameter karakteristik
kromatografi kertas dan KLT. Harga Rf untuk
senyawa yang terpisah selalu <1. Harga Rf yang
paling baik yaitu antara 0,3-0,6. Jika digunakan
untuk menunjukan kemurnian, harga Rf senyawa
uji dengan baku pembanding harus sama. Harga Rf
yang
2. Harga hRf : harga Rf dikali 100, hasilnya bilangan
utuh bntara 1-99
3. Harga Rst : perbandingan jarak tempuh senyawa
yang hendak diperiksa terhadap jarak tempuh
senyawa pembanding.
Kromatografi Kertas Horizontal
 Kromatografi Kertas Horizontal
 Merupakan salah satu jenis pengembangan dari
kromatografi kertas.
 Untuk pengembangan kromatografi kertas
horizontal dibutuhkan cawan petri yang sama
besarnya dengan tepi ditangkupkan satu sama lain
sebagai bejana pengembang.
 Pelarut pengembang dialirkan dari bawah dengan
bantuan kapiler kertas atau sumbu kapas pada titik
pusat kromatogram atau dari atas dengan
melubangi, diteteskan dengan bantuan pipet yang
sesuai.
 Kertas dipotong memanjang sesuai ukuran bejana

yang akan digunakan.

 Kertas yang dipakai adalah kertas Whatmann yang

secara komersial tersedia dalam berbagai macam

ukuran dan lembaran. Biasanya dipakai kertas
Whatmann no. 1 dengan kecepatan sedang.
 Cara Kerja
Penyempurnaan pemisahan dilakukan dengan elusi
berturut-turut dalam dua arah yang tegak lurus.
Cara Kerja :
1. Melakukan elusi dengan teknik menaik atau
menurun hingga bercak paling cepat mendekati
tepian kertas.
2. Kertas diangkat, dikeringkan, diputar 90o lalu elusi
dengan sistem pelarut yang berbeda.
3. Komponen yang tidak terpisah sempurna dalam
pelarut satu dapat sempurna dengan kombinasi
tersebut.
Kromatografi kertas horizontal
 Daftar pustaka
 Harmita. 2006. Buku Ajar Analisis Fisikokimia. Depok:

Departemen Farmasi FMIPA UI

 Harbone, J.B. 1987. Metode Fitokimia: Penentuan cara

modern menganalisis tumbuhan oleh J.B. Harbone, terbitan

ke-2, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang
Soediro. Bandung: Penerbit ITB

 J.R., Herman. 1988. Analisis Farmasi oleh Herman J. Roth,

diterjemahkan oleh Sarjono Kisman dan Slamet Ibrahim.

Yogyakarta: Gajah Mada University Press
 Daftar Pustaka
 Sriningsih, et.al. 2010. Analisa Senyawa Golongan Flavonoid

herba Tempuyung (Sonchus arvensis L.) Jakarta : Fakultas

Farmasi Universitas Pancasila.

 Syamsul. 2011. Praktikum Fisiologi Tumbuhan Fotosintesis.

Surabaya : Departemen Biologi Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Airlangga.

 Adamovics, John A.Chromatographic Analysis of

Pharmaceutical: second edition, Revised and Expanded.
Princeton, New Jersey: Cytogen Corporation.
 http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardG
rades.aspx
http://www.mn-net.com/tabid
 http://train-srv.manipalu.com/wpress/?p=87593
 http://faculty.ksu.edu.sa/noa/Documents/Chromatography.p
pt
 http://www.pharmacopeia.cn/v29240/usp29nf24s0_c621s4.
html
 http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/l
ab4/design1.html
 http://wiro-pharmacy.blogspot.com/2009/10/kuliah-
kromatografi-kertas.html
 http://chemistry.about.com/od/imagesclipartstructures/ig/L
ab-Equipment---Instruments/Paper-Chromatography.htm