• Álvarez Cardenas María de

Lourdes.
• Artega Hernández Alexander.
• Cruz Rodríguez Andrea.
• Marín Sánchez Margarita.
• Pacheco Segura Bryan.
• Piña Perez Karina.
 Gusano cogollero de maíz

Spodoptera frugiperda
 Ampliación de cultivo de insectos

línea celular de
Spodoptera frugiperda
(sf9)

Spinner Flask de 3L sin

Medio de
burbujeo
cultivo
IPL/41;triptosa
fosfato y Suero
fetal bovino.
 En el crecimiento exponencial viable
era de 1.2 x 106 células / ml

 Y el crecimiento cercano (No

exponencial) fue superior a 0.8 x 106

 El crecimiento lineal es diagnostico

de limitación de oxigeno.
Capacidad de transferencia de oxígeno

• Un matraz aforador de 3L es
adecuada para soportar solo
0,7 x 106 células / ml sin limitar
la tasa de crecimiento.

• Esto está de acuerdo con el

crecimiento observado en el
hilandero de 3 L (Fig. 1)
Fermentador por
burbujeo. (Airlift)

 Permite buena agitación

disminuyendo el
rompimiento celular.
 Tiene una circulación ligera
para mantener las células
en suspensión.
 El gas es inyectado por la
base del fermentador.
 La capacidad de transferencia de
oxígeno aumenta conforme la
capacidad del recipiente aumenta.

 Estos factores sugieren que el

fermentador por burbujeo es buena
opción para el cultivo de células de
insecto.
 Se agregó al medio
polialcohol plurónico F-68
(0.1 % p/v) para mejorar el
cultivo de células de insecto.
 Protege a las células de un
daño debido al burbujeo.
 Evita la formación de espuma
en el cultivo.
 El diametro de las burbujas fue
de 0.1 a 1 cm.
 No son esferas rígidas ∴ su
tensión superficial es menor a
esferas pequeñas.
 Suben a una velocidad
uniforme ∴ colisionan entre sí.
 Esto previene el daño a las
células.
 La figura 2 muestra la curva de crecimiento
de células de insecto Sf9 en fermentador.

 Aprox. 5x10^6 células/ml en 7.5 días.

Preparación del medio.

 Se buscaba desarrollar un
medio libre de suero para
producción a gran escala y a
bajo costo, debido a que
componentes proteicos como
la hemolinfa, suero de
mamíferos o yema de huevo
son costos, pueden producir
espuma y dificultan la
recuperación del producto
recombinante.
 Se decidió usar un medio basal
IPL/41 el cual suministra nutrientes
básicos .

 Se agregó extracto de levadura 4g/L

para suministrar nutrientes
adicionales (se ultrafiltró para
remover contaminantes residuales
de alto P.M. los cuales pueden
teneractividad proteolítica).

 El adicionamiento de lípidos fue

problemático.
Suplemento
de lípidos.
• La tabla 2 compara la producción de
proteína recombinante en los medios
opuestos.

• 15 generaciones fueron necesarias

para la adaptación de las células en
medio sin pt.
 El cultivo primero es inoculado a 0.1 x 10^6 Sf9cel/ml.

 Después se infecta con el baculovirus recombinante .

 La infección debe de ser a una alta densidad cellular, pero

durante la fase exponencial.

 El crecimiento celular se detiene y la expresión de la rM-

CSF empieza un día después de la infección.

 Aprox. El 50% de rM- CSF se presenta dos días después de

la infección.

 El pico de producción se presenta a los 4-5 días después

de la infección, cuando la lisis celular comienza.
PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA
RECOMBINANTE
Análisis SDS PAGE
EXPRESIÓN
BACULOVIRUS
M-CSF

 Imagen 5. Análisis SDS PAGE del

producto M-CSF. Dos bandas de M-
CSF (que se supone que resultan de
la heterogeneidad de glicosilación)
representan el 10% de la proteína
total del cultivo infectado con
AcNPV recombinante cultivado en el
medio libre de proteína.
 La forma activa de la proteína se encuentra
extracelularmente en forma de homodímero,
estando unidos los monómeros por un enlace
disulfuro.

M-CSF expresado en insectos es similar al M-CSF humano nativo.

RESULTADOS

El M-CSF se expresa a 40 mg/l en un medio de burbujeo libre de proteínas a bajo costo.

 PROTOCOLO

Se utilizó un baculovirus
recombinante, Autographa
californica, virus de la polihedrosis
nuclear (AcNPV) para infectar a las
células Sf9 para la producción del
Células Sf9 se obtuvieron Después de su obtención factor simulador de colonias de
de Don Rio (U.C. se mantuvo a las células macrófagos humanos, M-CSF. El cuál
Berkeley) donde se en cultivo en suspensión se preparó utilizando un vector de
mantuvieron en medio con medio IPL / 41 transferencia derivado del plásmido
TNM-FH de Hink con suero suplementado con caldo pAc401
de ternera fetal al 10%. de triptosa fosfato y suero
fetal bovino. Al cuál
también se le añadió
poliolplurónico F68 para
proteger a las células de
estrés hidrodinámico.

El absorción de oxígeno se midió
utilizando un monitor de oxígeno
biológico YSI-5300 equipado con una
cámara de oxígeno micro agitada y
controlada con una temperatura de
0,6 ml (YSI 5356).
El medio se agitó de 75-100 rpm a
27°C.
Y se midió la densidad total del
medio.
Los cálculos de KLa se realizaron
midiendo la velocidad de aumento
del oxígeno disuelto utilizando una
sonda de oxígeno estándar.
Mezcla controlada de nitrógeno /
aire-oxígeno usando un controlador
de fermentador diseñado
 Mediciones y condiciones de cultivo

• Aceite de hígado de
bacalao.

Componentes • Esteres metílicos de

del suero ácidos grasos
poliinsaturados.

• Colesterol
Suero libre de suero • 100 g/L en agua desionizada.
para Sf9 • Yeastolato • Ultra filtró con un cartucho de
fibra hueca PM10
Monitor de oxigeno
YSI-5300
Capacidad de
Agitación de 75-100
transferencia de
RPM, 27°C
oxigeno
- Medicion con vel.
de O

Modelo ZF Coulter
Viabilidad Counter.
- Densidad celular