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METODOS MOLECULARES II

MICROBIOLOGIA CLINICA
Profesor:
Boris Barrera V.
Estudiantes:
Natalia Jara F.
Esteban Díaz C.

ESTEBAN DIAZ CASTAÑEDA


NATALIA JARA FREIRE
HISTORIA REACCION POLIMERASA EN CADENA
Técnica concebida por el Dr. Kary Mullis en 1986
Buscaba la amplificación de una región específica de DNA,
usando nucleótidos, trifosfatos y polimerasa de DNA.
La idea fue multiplicar una hebra de DNA millones de veces, demostrando
la aplicabilidad de la técnica, aunque de manera poco eficiente.
Fue cuando comenzó a emplear polimerasas de DNA termoestable,
extraídas de microorganismos hemofílicos, inicialmente la polimerasa
llamada Taq, procedente de Thermus aquaticus.
PCR
Técnica enzimática in vitro utilizada para amplificar exponencialmente una región
determinada de DNA, situada entre dos regiones del mismo, cuya secuencia es
conocida, a partir de una mezcla de ácidos nucleicos.
PCR EN TIEMPO REAL

PCR en tiempo real fue reportada por


primera vez en un artículo de Higuchi y
colaboradores.
Estos autores, utilizando una cámara para
monitorear reacciones de PCR durante el
curso del termociclado, detectaron la
acumulación de ADN doble cadena en cada
ciclo de PCR, evidenciado por un
incremento en la fluorescencia producto
de la adición de Bromuro de Etidio en la
reacción.
PCR EN TIEMPO REAL
Los procesos de amplificación y detección se producen de manera
simultánea en el mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción
posterior. Además, mediante detección por fluorescencia se puede medir
durante la amplificación la cantidad de DNA sintetizado en cada momento,
ya que la emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional
a la cantidad de ADN formado.

Los sistemas de detección por fluorescencia empleados en la PCR a tiempo


real pueden ser de dos tipos:
• Sondas específicas marcadas con Fluorocromo
• Agentes Intercalantes
PCR TIEMPO REAL
Sondas de • Sondas TaqMan
Hibridación • Moléculas Beacons
Específicas • Sondas FRET

Agentes
Intercalantes
• SYBR Green I
PCR EN TIEMPO REAL
Sondas de Hibridación Específicas Agentes Intercalantes
PCR EN TIEMPO REAL
SONDAS TAQMAN

• Poseen un fluoróforo en su
extremo 3' y una molécula en
el 5' que bloquea su emisión
de fluorescencia «quencher»
esta sonda marcada híbrida
específicamente en la parte
central del producto de PCR a
obtener.
PCR EN TIEMPO REAL
Moléculas Beacons
• Consta de una única sonda que tiene
secuencias complementarias entre sí para
formar una estructura de horquilla están
conectados dos moléculas. Uno de ellos es un
fluorocromo. La estructura de horquilla se
acerca, las dos moléculas entre sí. En
presencia de luz de longitud de onda
apropiada fluorocromo en un extremo que se
activa, pero no emite luz, como la pantalla de
capturar su energía.
PCR EN TIEMPO REAL
Sondas FRET

• El sistema se compone de dos sondas


que se unen a secuencias adyacentes del
ADN diana. Una de las sondas lleva un
donador en el extremo 3’ y la otra un
aceptor en el extremo 5’. Cuando las
sondas están hibridadas, los dos
fluorocromos están próximos. Al ser
excitado, el donador transfiere su
energía al aceptor que, a su vez, emite la
fluorescencia que detecta el lector del
equipo
PCR TIEMPO REAL
AGENTES INTERCALANTES
SYBR Green I
Detectan DNA de doble cadena
producidos durante la reacción de
amplificación Es un método estándar
que consiste en añadir un agente
intercalante de la doble cadena o un
fluoróforo, este aumenta
notablemente la emisión de
fluorescencia cuando se unen a ADN
de doble hélice.
PCR EN TIEMPO REAL
Extracción de Ácidos Nucleicos
• 1. PASO PREANALITICO CRITICO
EXTRACCION MANUAL EXTRACCION AUTOMATIZADA

1. USO DE FENOL CLOROFORMO PARA LA 1. EXTRACCION DE ACIDOS MAS
EXTRACCION. REPRODUCIBLE
2. MULTIPLES MANIPULACIONES 2. MENOR MANIPULACION DE LA MUESTRA
3. MAYOR NUMERO DE MUESTRAS 3. EQUIPOS CERRADOS POR LO QUE EXISTE
4. MAYOR CONTAMINACION MENOR GRADO DE CONTAMINACION
5. PERSONAL CALIFICADO 4. MAYOR COSTO DE EQUIPOS
6. CONTROL DE CALIDAD INTENSO
PCR EN TIEMPO REAL

Sistema de extracción de Hisopo


• El kit de sistema de tubos para
extracción con algodón es un
método simple para una rápida y
eficiente recuperación del
espécimen pegado y absorbido en
las fibras del algodón.
PCR EN TIEMPO REAL

• Identifica productos específicos de PCR


ANÁLISIS DE LA CURVA DE TEMPERATURA DE FUSIÓN
tiempo real mediante el análisis de
curvas de Tº de fusión.
• Tiene relación con el contenido de
Guanina-Citocina, tamaño de los
amplicones y la secuencia de los
mismos.
• La determinación se realiza al final de
la reacción de amplificación.
• Mide la fluorescencia entre 50 ºC y
95ºC
VIRUS
VIH
• Virus de inmunodeficiencia humana
• Productor de SIDA
Diagnosticode
Diagnóstico VIH
VIH
• Serología
• Detección de antígeno viral
• Aislamiento en cultivos
• Identificación de material génico (previa aparición de Ac)
-ADN proviral: PCR Anidada
-ARN viral: PCR en tiempo real
• Métodos PCR: Más sensibles y específicos
-Recién nacidos
-No seropositivos o indeterminados
PCR
PCRanidada
anidada
• Mayor especificidad y sensibilidad
• No cuantifica muestra
• ADN proviral
• Gen gag
• Control de B-hemoglobina como conservación y purificación
PCR en tiempo real anidada
• Dos rondas de amplificación
• Dos pares de primers diferentes para cada ronda
• Amplificación de región de DNA primario extenso
• Amplificación de región especifica desde el fragmento primario
Carga viral
• Cuantificación de carga viral:
-Pronostico de progresión una enfermedad viral
-Relacionado a replicación activa del virus
-Puede ser expresado en partículas / ml
• Útil en infecciones virales crónicas
• Pacientes con trasplante de médula ósea y órganos.
• Evalúa evolución de infección
• Monitoreo de efectividad de tratamiento
Métodos de determinación
• NABSA “Nucleic Acid Sequence Based Amplification”
-Amplificación exponencial de una muestra de DNA o RNA
(RNA principalmente) viral.
-Diagnostico rápido de serotipo HIV-1
-Isotermico 41°C
-Cuantificación por electroquimiluminiscencia
• bDNA “Branched DNA assay”
Métodos de determinación

• RT-PCR
1. Amplicor HIV-1
-400-750.000 copias/ml
2. RT-PCR real time (Roche)
- COBAS TaqMan,
FRET, Beacons
3. Light cycler /TaqMan probe HIV-2
5-500.000 copias/ml
160; 89 bp fragment of gag gene
Amplicor HIV-1
• RT PCR
• Consta de 5 pasos:
1. Preparación del especimen
2. PCR de transcriptasa reversa: Se genera un DNA complementario (cDNA) desde la
molécula de DNA viral del HIV-1
3. Amplificación por PCR: Amplificación por PCR normal con primers específicos
para el cDNA producido.
4. Hibridación de los productos amplificados a sondas de oligonucleótidos
específicos
5. Determinación colorimétrica de los complejos (Sonda-DNA amplificado)
mediante una reacción enzimatica (se agrega una enzima – peroxidasa- que se
une a esta secuencia, tras un lavado y remoción de aquella que no haya sido
conjugada, se agrega un sustrato –peroxido de hidrogeno- para generar la
reacción)
Métodos de determinación
• Genotipificación VIH
• Resistencias a fármacos retrovirales (RAMs)
• VIH-1: 9 subgrupos A-J
• Chile: Predominancia VIH-1 tipo B
• RT-PCR
-ViroSeq™ HIV-1 genotyping system
-TRUGENE® HIV-1 genotyping system (transc. Reversa)

• Otros:
1. Antigenemia viral
2. Determinación de p24
Métodos de determinación
• Otros:
1. Antigenemia viral
2. Determinación de p24

• Transcriptasa reversa: los inhibidores nucleósidos de la


transcriptasa reversa (INTR) y los inhibidores
no-nucleósidos de la transcriptasa reversa atacan a esta enzima
• Integrasa: los inhibidores de la integrasa
atacan a esta enzima.
• Proteasa: los inhibidores de la proteasa
atacan a esta enzima.
• gp41: los inhibidores de la fusión atacan a esta
proteína de la pared exterior del VIH.
Virus respiratorios
• Mortalidad en infantes e inmunosuprimidos
• Complicaciones sistémicas severas del tracto respiratorio
inferior
• Influenza A, B
Influenza
• Familia Orthomyxoviridiae
• Grupos:
-A: H1N1
-B
-C
• Nariz, garganta y pulmones
• Transmisión rocíos y gotas
Influenza-Diagnostico
• Diagnostico oportuno para control y tratamiento temprano.
• RT-PCR:
Precedida de una transcripción inversa para transformar en ADN
cualquiera de los 8 segmentos de ARN que contiene el genoma de los virus
de la gripe A y B, o de los 7 segmentos del genoma del virus de la gripe C.
-Alta sensibilidad
-Rapidez
-Blancos: gen M1 matrix, Matrix protein A, Hemgglutinin gene B,
Neuroaminidasa
• Cultivos celulares
-Menor sensibilidad
- Lento 24-48 hrs
ParaInfluenza
• Broquiolitis, pneumonía, niños e inmunocomprometids
• Multiplex de Rt-PCR
SARS-Cov
• Neumonía atípica contagiada vía aerea y secresiones
• Laboratorio nivel de bioseguridad 3°
• RT-PCR se ha descrito más sensible
Hepatitis
Hepatitis
• Virus productores de inflamación hepática
• A, B, C, D y E
• Entregan identidad al virus
• RT-PCR
-SYBR green., TaqMan, Beacons, FRET
con LightCycler, ABI PRISM, Mv4000
• HAV: fragmento de 87-bp, 77-bp
HBV: 174 o 241-bp, 259-bp, 100 b fragmentado
• HBC: 50-bp
Hepatitis
• Serología
-A: Ac IgM. 10 días a 6 meses.
Ac IgG. Toda la vida (post. Enfermedad)
-B: Det. Ag virales
Ag. E
Det. De Ac virales (Ac anti-superficie sHB, Ac anti-e eHB, e, anti
core cHB)
• Para el pronostico se considera que a mayor carga viral basal,
menor probabilidad de una respuesta sostenida en tratamiento.
Caso Clinico
• Hombre de 60 años con antecedentes de cáncer de colon, llega de
urgencia al hospital Barros Luco. Presenta malestar general, fatiga,
escalofríos, sudor nocturno, fiebre, taquipnea. Se solicita un
hemograma y este revela una leucocitosis de 30.000xmm3 más
anemia microcitica/hipocromica. Ante esto, se solicita un
hemocultivo. En la siembra en PAS se observa el crecimiento de
colonias grisaceas, no hemoliticas y pequeñas. Se realiza un test de
Pyr más un Lap y ambos resultan positivos. Posterior a esto, se
hace un test de arabinosa y telurito, en donde dan por resultado (+)
y (-) , respectivamente.
• Resultado:

Septicemia por Enterococcus faecium.


Cocacea gram positivo, flora del aparato
digestivo bajo. Ante sangrados producto
de cáncer de colon, es posible que un
cuadro de bacteremia haya evolucionado
e irrumpido en la crisis.