CROMATOGRAFÍA

DE LÍQUIDOS
(HPLC)
INTRODUCCIÓN

En 1902 Tsweet pudo

separar diferentes
pigmentos de un
extracto de una planta

Cromatografía
Guichon G. (1994) Fundamentals of Preparative and Nonlinear Chromatography.
FUNDAMENTOS
 CROMATOGRAFÍA

 Es un proceso de sorción, donde se coloca en contacto una corriente líquida

(gaseosa) que contiene el soluto de interés con un sólido contenido en una
columna

 Sorción: Retención de una sustancia por otra cuando están en contacto;

incluye las operaciones de absorción, adsorción, intercambio iónico y diálisis

Seader J. D. (2006) Separation Process Principles.

 Se ponen en contacto un liquido que tiene solutos disueltos con un
solido, donde se transfieren los solutos del liquido hacia el solido
debido a las propiedades especificas de cada compuestos, como es el
gradiente de potencial, hasta alcanzar el equilibrio. obteniendo en el
efluente la separación debido a las diferentes propiedades de las
sustancias.
 HPLC
 HPLC (inicialmente High Pressure Liquid Chromatography)

 HPLC (actualmente High Performance Liquid Chromatography)

Cunico R. L.; Gooding K. M.; Wehr T. (1998) Basic HPLC and CE of Biomolecules. Bay Bioanalytical Laboratory. CA.
FUNDAMENTOS

 Cuenta con dos fases

 Fase Líquida: Se encuentra contenido el soluto de interés.

 Fase Estacionaria: Soporte sólido donde el soluto interacciona.

 Soluto: Analítico que será transferido

FUNDAMENTOS DE LA CROMATOGRAFÍA

εP VI
D
Va

v VE

 Dispersión dinámica
 Velocidad de transferencia
 Velocidad de adsorción y desorción
 Equilibrio
ADSORCIÓN: Fenómeno por el cual un
sólido o un líquido atrae y retiene en su
superficie gases, vapores, líquidos o cuerpos
disueltos

Guichon G. (1994) Fundamentals of Preparative and Nonlinear Chromatography.

 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA

 Exclusión
 Intercambio iónico
 Afinidad
 Interacción hidrofóbica
CROMATOGRAFÍA POR EXCLUSIÓN DE
TAMAÑO
En este proceso no hay interacción del analito con la
fase estacionaria.
La separación esta basada por el tamaño físico de la
molécula.
 Aquellas moléculas con un tamaño  En cambio aquellas moléculas
mayor que el diámetro de los poros capaces de penetrar en las
de las particulas, sólo podran partículas se verán retrasadas por
moverse en su camino, a través de lafase estacionaria; en mayor
la fase estacionaria, en el espacio medida, cuanto menor sea su
que queda entre las partículas; y tamaño.Por lo tanto, las moléculas
por lo tanto, no se verán retrasadas eluyen en este tipo de
en su descenso. cromatografía por orden
decreciente de tamaño molecular.
 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO
IÓNICO
 La separación esta basada en las interacciones electrostáticas
del soluto con la fase estacionaria.
CROMATOGRAMA

0.70

C 0.60

0.50

0.40

mvolts
0.30

0.20

0.10

0.00
0 2 4 6 8 10 12

t Tiempo (s)

13
Por ejemplo, si nosotros metemos un pulso de una mezcla con dos
compuestos en una columna de intercambio aniónico, cuando los solutos
pasan a través de la columna debido a su gradiente de potencial va a ser
separados. En este caso, el compuesto azul es retenido mayormente por el
sólido, lo cual provoca un retraso en la salida de la columna.
 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
Se utilizan las características de las moléculas
(Antígeno-Anticuerpo, Enzima-Sustrato, DNA-
Molécula blanco)
 La Cromatografía de Afinidad permite la separación de mezclas
proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado
ligando.
 En este caso, las proteínas que se retienen en la columna son
aquellas que se unen específicamente a un ligando que
previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la
columna.
 Después de que las proteínas que no se unen al ligando son
lavadas o eluidas a través de la columna, la proteína de interés que
ha quedado retenida en la columna se eluye o libera mediante el
empleo de una solución que contiene bien ligando libre u otro
compuesto que rompa la interacción entre el ligando y la proteína.
 CROMATOGRAFIA DE INTERACCION
HIDROFOBICA
 Se basa en una débil
interacción hidrofóbica del
soluto con la fase
estacionaria.

 La fase estacionaria
consiste de pequeños
grupos no polares unido a
un soporte polimérico
hidrofílico.
Cunico R. (1998) Basic HPLC and CE of Biomolecules..
 La técnica de Interacción Hidrofóbica (HIC) separa las proteínas en base
a su hidrofobicidad superficial, y se caracteriza por la adsorción de las
biomoléculas a la superficie débilmente hidrofóbica de la resina en una
solución fuertemente salina y su posterior elución mediante una
gradiente salino negativo.

 Dicho gradiente suele iniciarse con una solución de 2-4M de Sulfato

Amónico, Sulfato Sódico, etc., disminuyendo gradualmente la
concentración hasta niveles de 0.1-1.0M
 CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA

La fase reversa explota las características de las

biomoléculas (peptidos, proteínas), basado en el
tamaño y la carga de la molécula.

La fase estacionaria es no polar y la fase móvil es va

cambiando su polaridad de polar a no polar.

Cunico R. L.; Gooding K. M.; Wehr T. (1998) Basic HPLC and CE of Biomolecules. Bay Bioanalytical Laboratory. CA.
USOS
ANALÍTICA VS. PREPARATIVA

 ANALÍTICA (Separa y Cuantifica)

 V pequeños.
 C bajas.
 Columnas pequeñas (μg)
 Partículas micrométricas (5-10 μm).

 PREPARATIVA (Recupera y Purifica)

 V alto con C baja.
 V bajo con C alta.
 Columnas grandes (mg)
 Partículas grandes (0.5 mm).
 Generalmente en la cromato analítica se trabaja con volúmenes
pequeños y soluciones diluidas y para aumentar la resolución de la
separación se utilizan partículas micrométricas del orden de 5 a 10
micras,
 Mientras que en la cromatografía preparativa el objetivo es purificar y
concentrar algún soluto de interés, por lo que se manejan ya sea
volúmenes grandes a baja concentración o volúmenes pequeños a alta
concentración.
 Nuestro interés es precisamente el segundo, purificar solutos de interes
industrial
PARTES DEL EQUIPO
SISTEMA CROMATOGRAFICO
HPLC
APLICACIONES
 MEZCLA DE PROTEÍNAS

1. Phe-Arg
2. Insulina (impura)
3. BSA (impura)
4. Mioglobina
5. Oválbumina (impura)

Columna: Jones Genesis C18, 4μ, 150 x 4.6 mm

Fase movil: A (0.08% TFA en H2O)/B (0.08% TFA en
ACN)
Gradiente: (Tiempo %B) (0,25)(18,95)
Flujo: 1 mL/min
Detector: UV/Vis

Catalogo Grace Davison Discovery Sciences (2010)

 ÁCIDOS PRESENTES EN JUGO DE NARANJA

1. Ácido tartárico
2. Ácido málico
3. Ácido Isocítrico
4. Ácido Cítrico
5. Impurezas de ácido málico (en estándar)

Columna: Jones Genesis AQ, 4μ, 150 x 4.6 mm

Fase movil: 0.1% H3PO4 en H2O
Flujo: 1 mL/min
Detector: UV/Vis a 210 nm

Catalogo Grace Davison Discovery Sciences (2010)

 BIODIESEL DENTRO DE
ESPECIFICACIONES
1. Mono-acilglicerol (MAG)
2. MAG
3. MAG
4. Fatty Acid Methyl Ester (FAME)
5. MAG
6. FAME
7. FAME
8. MAG
9. FAME
10. Di-acilglicerol (DAG)
11. Tri-acilglicerol (TAG)

Columna: HP C18 HiLoad, 5μ

250 x 4.6 mm
Fase movil: A (Acetonitrilo)/B (Diclorometano)
Gradiente: (Tiempo %B) (0,0)(5,15)(30,70)(32,70)
Flujo: 1 mL/min
Catalogo Grace Davison Discovery Sciences (2010)
Detector: ELSD (Detección por dispersión ligera evaporativa)
 BIODIESEL FUERA DE ESPECIFICACIONES
1. Mono-acylglycerol (MAG)
2. MAG
3. MAG
4. Fatty Acid Methyl Ester (FAME)
5. MAG
6. FAME
7. FAME
8. MAG
9. FAME
10. Di-acylglycerol (DAG)
11. Tri-acylglycerol (TAG)

Columna: HP C18 HiLoad, 5μ

250 x 4.6 mm
Fase movil: A (Acetonitrilo)/B (Diclorometano)
Gradiente: (Tiempo %B) (0,0)(5,15)(30,70)(32,70)
Flujo: 1 mL/min
Detector: ELSD
Catalogo Grace Davison Discovery Sciences (2010)
 HIC
 INTERACCION
HIDROFOBICA
 INTERCAMBIO
IONICO
AFINIDAD