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Epidemiología Molecular:

Genotipificación de Brucella spp., aislada en diferentes


reservorios en el Ecuador; resultados preliminares

Elizabeth Minda A. (elizabeth.minda@gmail.com)


Jorge Ron Román
Paulina Fernández

Centro Internacional de Zoonosis


UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
Brucelosis - Generalidades
La Brucelosis es una enfermedad infecto-contagiosa
causada por bacterias del género Brucella spp.

ESPECIE HEMBRA MACHO

Aborto en el último tercio Orquitis uni o bilateral,


Bovino
de la gestación. epididimitis.
Aborto, esterilidad y
Porcino Parálisis y cojeras.
aumento de la mortalidad.
Epididimitis uni o bilateral
Ovino Los abortos son raros.
con atrofia testicular.
Los abortos pueden Orquitis, epididimitis,
Canino
repetirse, metritis. prostatitis.

La relación causal entre el organismo y la enfermedad fue establecida por


Dr. David Bruce (microbiólogo) en 1887. (Aréstegui et al., 2001)
Ciclo de Transmisión
ANIMALES ENFERMOS CONTACTO
(placenta, abortos, heces, secreciones
vaginales)

INOCULACIÓN/INHALACIÓN
(vacunas vivas, muestras contaminadas)

INGESTIÓN
(leche cruda y derivados lácteos)
Epidemiología - Brucelosis
Mecanismos de transmisión depende de las distintas áreas geográficas,
especies de Brucella spp., condiciones climáticas, distribución de la población
de riesgo, tipos de producción pecuaria, entre otras.

González (2009) determinó una seroprevalencia de 1.5%


en productores pecuarios.
- RB / SAT-EDTA / iELISA

Faz (2011) estableció una seroprevalencia global de 1.2%


en trabajadores de catorce camales.
- RB / SAT-EDTA
Fuente: http://www.oie.int

Olmedo (2010) encontró una prevalencia de 11.96% (33/276)


- Aislamiento y biotipificación
- Brucella abortus

Fuente: Minda-Aluisa, 2010


Brucelosis- Agente etiológico
Cocobacilo Gram negativo

Patógenos intracelulares facultativos Fuente: Investigación CIZ

no móviles y no formadores de esporas

Clasificación Sistemática
Dominio: Bacteria
Filo: Proteobacteria
Clase: Proteobacteria alfa
Orden: Rhizobiales
Familia: Brucellaceae
Género: Brucella
Fuente: http://www.cdc.gov/
Fuente: http://www.uniprot.org
Especies y Biotipos (variedades genéticas)
Especies Biotipos Hospedador natural Referencia

Cabra, oveja, bovinos,


B. mellitensis 1-3 Marston, 1859
cánidos, hombre

B. abortus 1 - 6, 9 Bovinos, cánidos, hombre Bruce, 1866

B. suis 1-5 Cerdo, cánidos, hombre Huddleson, 1929

B. ovis Ninguno Ovinos Buddle, 1956


Carmichael & Bruner,
B. canis Ninguno Cánidos, hombre
1968
Stoenner & Lackman,
B. neotomae Ninguno Rata del desierto
1957
B. pinnipedialis Ninguno Focas, lobos marinos Dawson et al., 2008

B. ceti Ninguno Delfines, ballenas Dawson et al., 2008

B. microti Ninguno Zorros Scholz et al., 2008

B. inopinata Ninguno Humanos Scholz et al., 2010


Brucella spp. – Diagnóstico (identificación)
Procedimientos laboriosos y de alto riesgo

Indirecto Directo

Rosa de Bengala
Microbiología
SAT-EDTA

ELISA

Skin Test

Anillo Coloreado en leche (MRT)

Fuente: Investigación Directa CIZ, 2012


Genética - Cromosomas

Figura 1. Circular representation of the two chromosomes of B. suis strain 1330.

Fuente: Paulsen et al., 2002


Taxonomía – Brucella spp.

Fuente: http://www.upm.es
Relaciones filogenéticas

Fuente: Michaux, 1997

Fuente: http://www.bio.davidson.edu
Filogenética de Brucella spp.
Fuente: Characho et al., 1997

95% de similitud en
el ADN genómico

100% de similitud
en fragmentos del
gen 16S rRNA

Género
Monoespecífico

(Fuente:
http://www.wipo.int)
Brucella melitensis biovar abortus 1
- Por la relación antigénica
- Estudios hibridación ADN-ADN
- Secuenciación del genoma y de genes 16S rRNA
Fuente: Orduña, 2001
Epidemiología Molecular: Genotipificación
El uso de la biología molecular en el diagnóstico de enfermedades infecciosas es
IMPORTANTE para poder establecer patrones epidemiológicos mas precisos.

Las diferentes investigaciones y análisis moleculares con los cuales


se han estudiado a Brucella spp., sirven para conocer la genética de
la especie y biotipos.

Biotipificación: Identificación de biotipos (conjunto


de fenotipos que corresponden a un mismo
genotipo) de la misma especie (Jones et al., 1982).

El hombre es susceptible a la infección


B. melitensis, B. suis (excepto por el
biovar 2), B. abortus y B. canis
Metodología - Generalidades
Extracción de ADN
(Método fenol/cloroformo)

IS711 PCR

Brucella spp. Otras


Suspensiones bacterianas
inactivadas
AMOS PCR Convencional

B. abortus bv 1, 2 o 4 B. melitensis bv 1, 2 o 3 Brucella spp.


B. suis bv 1
B. ovis
AMOS PCR Modificada

RB51/S19
Muestras Biológicas 8
5 3

Bovino
Caprino
Canino
Humano
78

Especie Muestra Aislados


Leche 37
Bovinos Órganos 40
Hemocultivo 1
Caninos Órganos 5
Caprinos Leche 8
Humanos Hemocultivo 3
TOTAL 94
Método (diagnosis molecular) - PCR IS711
MP
IS  Secuencia de Inserción

260-bp
IS711 o IS6501

MP El número de copias de IS711 varía en el


genoma de las especies de Brucella,
van desde las 7 de B. abortus, B.
melitensis y B. suis a más de
30 en B. ovis y en las cepas de
Brucella aisladas de los mamíferos
Fuente: Investigación Directa CIZ, 2012
marinos (Ocampo-Sosa & García Lobo, 2008).
Método molecular (diagnosis diferencial):
AMOS PCR convencional

731-bp 976-bp
498-bp

285-bp

Fuente: Bricker et al., 1994


Método molecular (diagnosis diferencial):
AMOS PCR modificada
Brucella abortus bv. 1
- Cepa Vacunal
- Cepa de Campo

498-bp

364-bp

178-bp
178-bp

Fuente: Bricker et al., 1995


Resultados Método Resultado esperado

IS711 PCR Brucella spp.


B. abortus bv 1, 2 o 4
AMOS PCR B. melitensis bv 1, 2 o 3
Cepas Convencional B. ovis
Vacunales. 9 B. suis bv 1
Brucella spp.,
40 AMOS PCR Cepa Vacunal
Modificada Cepa de Campo

Fuente: Bricker et al., 1994; Bricker et al., 1995


42.6%

MP
MP
Cepas de
Campo. 31

498 bp

MP
MP

Otras. 14

Fuente: Investigación Directa CIZ, 2011


Especie Muestra IS711 Amos Conv. Amos Mod.
B. abortus bv. 1, 2 o 4 19 (cepa campo)
35 (+) B. abortus bv 1 2 (cepa vacunal)
Leche Brucella spp. 14 (n.i.)
2 (-) --- ---
Bovino B. abortus bv. 1, 2 o 4 3
31 (+) B. abortus bv 1 6
Órganos Brucella spp. 22
9 (-) --- ---
Hemocultivo 1 (+) B. abortus bv. 1, 2 o 4 1
Canino Órganos 5 (+) B. abortus bv. 1, 2 o 4 5
B. abortus bv. 1, 2 o 4 0
5 (+) B. abortus bv 1 1
Caprino Leche Brucella spp. 4
3 (-) --- ---
Humano Hemocultivo 3 (+) B. abortus bv. 1, 2 o 4 3
TOTAL 94
Conclusiones
• El hallazgo de aislados de Brucella spp., en diferentes especies de
hospedadores animales en el Ecuador, demuestra la importancia
que esta zoonosis tiene en el Ecuador.

• La utilización conjunta de técnicas microbiológicas y moleculares,


aporta información valiosa en el análisis de la Epidemiología
Molecular.
• Relación Fenotipo-Genotipo

• Al no identificar un gran número de cepas de Brucella spp., es


necesario buscar metodologías alternativas que permitan
caracterizarlas: VTNR’s (HOOF- Print)

• Debido a un alto porcentaje de cepas vacunales encontradas en el


estudio, se concluye que una mala vacunación es una causa
probable de brucelosis en el Ecuador.
Agradecimientos
• Centro Internacional de Zoonosis
▫ Washington Benítez
▫ Jorge Ron
▫ Gustavo Echeverría
▫ Paulina Fernández
▫ Richar Rodríguez
▫ Lisbeth Olmedo
▫ Daniela Barzallo

• University of Liege, Belgium. UREAR-ULg


▫ Claude Saegerman

• Department of Animal Health, Institute of Tropical Medicine.


Anveres-Belgica
▫ Jeff Brandt
▫ Dirk Berkvens

• Department of Bacteriology and Immunology, Veterinary and


Agrochemical Research. Centre, Brussels-Belgium.
▫ David Fretin
…la ciencia no es …ni misterio de iniciados, ni
privilegio de los aristócratas de la mente, sino el
medio único que tiene el hombre de explicarse
las leyes de la vida…

José Martí