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Universidad Mayor San Simón

Facultad de Medicina
Segundo Año

Dra. Rosse Mary Yañez Villanueva MSc. P.hD


Fac. Medicina UMSS 2017
• Avances de los conocimientos en el campo
de la genética
• Interrelación con el desarrollo tecnológico
• Tecnología del ADN recombinante
CONTENIDOS
1. Recombinación genética
2. Procedimiento general de clonación
3. Obtención de genes específicos
4. Recombinación in vitro
5. Transformación
6. Selección del gen recombinado
7. Procedimientos de expresión
8. Aplicaciones, riesgos y perspectivas

de la Ingeniería genética
TEMAS ABORDADOS

Expresión de la IG y su regulación

Transcripción Traducción

Replicación

ADN ARN PROTEÍNAS

Daño al ADN Enfermedades moleculares


y mutaciones
Proceso mediante el cual se produce el intercambio
de grandes segmentos de ADN

Principal
Principal mecanismo
mecanismo evolutivo
evolutivo
(explica
(explica la
la gran
gran diversidad
diversidad de
de organismos
organismos
de
de una
una especie)
especie)
RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA
Requiere la presencia de grandes segmentos de
homología entre la molécula de ADN donante y
la receptora

TIPOS DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA

TRANSFORMACIÓN CONJUGACIÓN
TRANSDUCCIÓN
TRANSFORMACIÓN

Molécula de ADN del medio, liberada por


otra bacteria, que es captada e
incorporada al cromosoma bacteriano
Experimentos
Experimentosde
deOswald
OswaldAvery,
Avery,Colin
ColinMacLeod
MacLeodyy
Maclyn
MaclynMcCarty
McCarty (1944)
(1944)
TRANSDUCCIÓN

Un virus asimila un segmento de


ADN de una célula infectada y lo
transfiere a otra que lo Incorpora
a su genoma.
CONJUGACIÓN

Traspaso de segmentos de ADN circulares


(plásmidos) entre bacterias
CONJUGACIÓN
RECOMBINACIÓN HETERÓLOGA

No requiere la existencia de homología entre


la molécula de ADN donante y la receptora
RECOMBINACIÓN SITIO-ESPECÍFICA

Cuando
Cuando un
un virus
virus infecta
infecta aa una
una bacteria
bacteria yy el
el
ADN
ADN viral
viral se
se integra
integra al
al bacteriano
bacteriano
RECOMBINACIÓN SITIO-ESPECÍFICA
Establecimiento de la lisogenia: bacteriófago 
RECOMBINACIÓN INTEGRATIVA EN EL FAGO LAMBDA
TRANSPOSICIÓN

Un segmento de ADN migra de una parte


a otra de la molécula, o de un cromosoma a otro
en los organismos diploides
Técnica que permite unir moléculas de ADN in vitro

Ha
Ha revolucionado
revolucionado elel estudio
estudio de
de la
la genética
genética de
de los
los
Eucariontes
Eucariontes yy ha
ha proporcionado
proporcionado fuentes
fuentes de
de
proteínas
proteínas específicas.
específicas.
SIGNIFICADO BIOLÓGICO DE LA RECOMBINACIÓN

• Factor trascendente en la evolución pues

permite la adquisición de nuevos caracteres que

pueden representar ventaja selectiva.

• En organismos con reproducción sexual

representa el mecanismo fundamental para la

creación de nuevos genotipos por redistribución

de genes parentales (meiosis).


SIGNIFICADO BIOLÓGICO DE LA RECOMBINACIÓN

• Mecanismo de defensa contra las mutaciones

dañinas haciendo perdurables las beneficiosas.

• Entre células somáticas embrionarias contribuye

a la gran diversidad de inmunoglobulinas

formadas por células linfoides.


SIGNIFICADO BIOLÓGICO DE LA RECOMBINACIÓN

Uno
Uno de
de los
los principales
principales mecanismos
mecanismos queque
intervienen
intervienen en en la
la gran
gran variabilidad
variabilidad de
de los
los
seres
seres vivos
vivos
1- La recombinación genética consiste en el intercambio
de grandes segmentos entre dos moléculas de ADN.

2- La recombinación genética puede ser homóloga


(transformación, transducción y conjugación) o
heteróloga (recombinación sitio-específica,
transposición), según el requerimiento de secuencias
homólogas entre la molécula donante y la receptora.
3- La recombinación genética desempeña un papel

esencial en la evolución y constituye un mecanismo

de defensa al separar las mutaciones beneficiosas de

las dañinas.
3. Procedimiento general de clonación
CLONACIÓN
• La clonación es el proceso por el que se
consiguen un duplicado genético, muchas
copias idénticas de un mismo segmento
gen (clones) u organismo

• Copia idéntica de un organismo ya


desarrollado de forma asexual .

• Se pueden clonar organismos pluricelulares,


células o genes
ETAPAS

1- Obtención de un segmento de ADN (gen) a partir


del genoma de un organismo dado.
CORTE: (en sitios específicos con endonucleasas de
restricción),

2- UNIÓN de este gen a una molécula de ADN plasmido


(ligasa) capaz de replicarse en una bacteria.

3- Establecimiento de un medio adecuado que permita


la propagación de la unidad de ADN así formada.
gen
Recombinación
in vitro vector
Obtención del gen
específico (plásmido
bacteriano)

transformación

hospedador
(bacteria)
La Clonación se basada en la transferencia nuclear, en la 
que  participan  dos  células;  la  del  individuo  donante  (su 
material genético) y la que lo acepta.  
TIPOS DE CLONACIÓN
 Terapéutica ( transplantes)
 Reproductiva
APLICACIONES DE LA CLONACIÓN

INVESTIGACIÓN APLICACIONES

CLONAR 
FABRICAR  VACAS, 
FRENAR EL APLICACIONES 
TEJIDOS U  CABRAS Y 
ENVEJECIMIENTO TERAPEUTICAS
ORGANOS OBEJAS
A PARTIR DE
COMBATIR  A PARTIR DE
ENFERMEDADES
DETECCIÓN Y  CELULULAS 
MADRE LECHE PURA
TRATAMIENTO

PARA CON
CLONAR  COMBATIR EL 
ESPECIES  Transplantes CANCER PROTEÍNAS 
DESAPARECIDAS HUMANAS
POR QUÉ ES POSIBLE LA CLOANACIÓN?

Un  determinado  animal  está  compuesto  por  millones  de 


células,  Esas  células  tienen  aspectos  y  funciones  muy 
diferentes.  Sin  embargo  todas  ellas  tienen  algo  en  común:  en 
sus  núcleos  presentan  unas  largas  cadenas  que  contienen  la 
información  precisa  de  cómo  es  y  cómo  se  organiza  el 
organismo: el ADN. 
CLONACIÓN HUMANA
El objetivo de la investigación de la
clonación humana nunca ha sido el
de clonar personas o crear bebés de
reserva.

La investigación tiene como objetivo


obtener células madre (terapia
celular.) para curar enfermedades;
más específicamente, de la
posibilidad de clonar ciertos tipos de
células. Por ejemplo, se podrían
clonar neuronas productoras de
dopamina para curar la enfermedad
de Parkinson.
CLONACIÓN HUMANA
clonación con fines terapéuticos,
por ejemplo: clonar órganos para
hacer trasplantes ya que no existiría
los problemas de rechazos

Permitiría posibilidades de
manipulación genética.
Las células en cultivo son un material
muy adecuado para introducir o
eliminar determinados genes y se
ampliarían mucho las posibles
modificaciones genéticas que las
técnicas actuales no permiten.
CLONACIÓN ANIMAL
• Por  clonación  animal,  han  sido  clonados 
varios  animales  como  ranas,  ratones,  ratas, 
yeguas, cerdos, etc. 
• La  clonación  animal  más  famosa  fue  la 
clonación de la oveja Dolly. 

• Desde el punto de vista técnico, los animales 
clonados también han presentado problemas: 
además de presentar un porcentaje mayor de 
malformaciones, padecen con frecuencia un 
síndrome que se manifiesta en que su tamaño 
es  mayor  de  lo  normal,  y  que  tiene 
consecuencias  negativas  para  su  salud  y 
desarrollo. 
CLONACIÓN DESDE EL PUNTO DE
VISTA RELIGIOSO
• Tras  la  intervención  realizada  por  los  científicos 
Ian Wilmut y Keith Campbell en la Oveja Dolly, 
el  Vaticano  publicó  un  documento  titulado 
Reflexiones sobre la clonación. 
• La  Iglesia  católica  sostiene  la  teoría  de  que 
permitir  la clonación humana implicaría una
violación de los principios fundamentales de
los derechos del hombre:  la  igualdad  entre  los 
seres humanos y la no discriminación.
4. Obtención de genes específicos
Métodos para la obtención de genes

1. Extracción directa del ADN de la célula

2. Aislamiento del ARNm correspondiente al gen

3. Síntesis artificial a partir de la secuencia de


aminoácidos
DOGMA CENTRAL
DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

expresión de la IG

Transcripción Traducción

Replicación

ADN ARN PROTEÍNAS

Retrotranscripción
REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR) 
• La reacción en cadena de la polimerasa se usa para amplificar
por síntesis un segmento limitado de DNA del cual se conoce la 
secuencia en los extremos. La técnica que consiste en replicar una 
secuencia de una cadena de DNA hasta infinitas veces.
  

  
REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR) 
Componenentes: Muestra de ADN
Diseño de los cebadores 
DNA Polimerasa 
Deoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) dATP, dGTP,
                              dCTP y dTTP 
Tampón de la reacción
5. Recombinación in vitro
1. VECTORES
2. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
3. ADN LIGASA
Molécula de ADN que se utiliza para introducir el gen
en una célula

1.
1. Capaz
Capaz de
de replicarse
replicarse
2.
2. Procedimiento
Procedimiento dede detección
detección
3.
3. Introducción
Introducción en
en una
una célula
célula
TIPOS DE VECTORES

1. PLÁSMIDOS BACTERIANOS

2. VIRUS (BACTERIÓFAGOS)

3. CROMOSOMA ARTIFICAL DE LEVADURA


Moléculas circulares de ADN extracromosómico que se
encuentran en muchas bacterias

Contienen
Contienen genes
genes esenciales
esenciales para
para la
la
supervivencia
supervivencia en
en determinados
determinados medios
medios
(acomodan
(acomodan los
los genes
genes más
más pequeños)
pequeños)
PLÁSMIDOS BACTERIANOS
ADN doble hebra, circular

Tamaño 1-200 kb

Replicación autónoma

Beneficio para bacteria hospedadora


(resistencia a antiobióticos)
Grandes moléculas de ADN construidas con los
centrómeros y telómeros de cromosomas de levadura
y segmentos de ADN extraños

Acomodan
Acomodan genes
genes de
de gran
gran tamaño
tamaño
• Insertos de 45 kb

• Vectores Lambda modificados


cos-inserto-cos+ plásmido

• El inserto es ligado por ER y


ADN ligasa

• Empacado en una partícula


Lamba

• Infecta E. coli
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
la «R» en RFLP
Aisladas a partir de bacterias, las usan como una forma
de sistema molecular para destruir (digerir) el ADN.

El nombre de cada enz proviene del de la bacteria a


partir de la que se aisla (ej- Sex AI Streptomyces
exfoliata).

Las enzimas más comunes en biologia molecular son


las que reconocen secuencias de nucleotidos
palindromicas de 4 a 6 pb (ej.- Rco RI

Cada enzima solo corta en su sitio de reconocimiento


específico.
 Restriction Fragment Length Polimorfismo
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Y SUS SITIOS DE ACCIÓN

Extremos
romos

Extremos
cohesivos
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
la «R» en RFLP

 Endonucleasas.

 Exonucleasas.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Endonucleasas  Las mas usadas en Ing. Genética


Cortan el dsDNA

Región especifica
(sitio de Enzimas de No Cortan
reconocimiento) Restricción su DNA

4,6,8 bases Sensibles a


metilación
Fragmentación del ADN del fago  con EcoRI o BamHI
MODIFICACIÓN-RESTRICCIÓN

metilasas
metilasas endonucleasas
endonucleasas

SAM
SAH

CH3 CH3 CH3

ADN propio ADN extraño

CH3 CH3 CH3


SISTEMAS DE MODIFICACIÓN-
RESTRICCIÓN
MECANISMO DE DEFENSA DE LAS BACTERIAS
CONTRA EL ADN INVASOR
Par 
endonucleasa R*EcorRV + metilasa M*EcorRV
de la misma especificidad (reconocen la 
misma secuencia)

Protector de modificación (metilación) proteje 
Protector de modificación (metilación) proteje
su propio ADN

Especificidad de las ER es importante a dos niveles:


1) ER debe cortar la secuencia que contiene el sitio de restricción
y no en secuencias que no lo contienen.
2) ER no deben romper el DNA del huésped
• Cataliza la formación de un enlace
fosfodiéster entre un extremo 3’ OH
y un 5’ PO4

• Une fragmentos de ADN


covalentemente

• No es eficiente con bordes


desafilados

• Usado en ingeniería genética

• Producida por E. coli recombinante


6. Transformación
Transferencia del vector recombinado al interior
de la célula

Infección
Infección vírica
vírica Transferencia
Transferencia directa
directa

Métodos
Métodos Químicos
Químicos Métodos
Métodos Físicos
Físicos
•Lipofección •Electroporación
•DEAE-dextrano •Choque térmico
•Cloruro de calcio • Microinyección
• Diferentes cepas por sus genotipos
(DH5α; DH10B, JM109).

• Elegir la cepa adecuada

• Muy transformable

• Si clonamos ADN genómico (se


metila) deben ser MCR-

• Mutación recA (evita la


recombinación homologa)

• endA mutantes (ausentes de


endonucleasas)
• La bacteria mas utilizada en biología
molecular

• Usualmente inofensiva
 Excepto E. coli O157:H7 
Diarrea

• Ventajas:
 Crecimiento rápido
 Crecimiento controlado
 Medio mineral con fuente de C
 Crecen en medio líquido, sólido
 Fácil conservación  4 ⁰C, -70 ⁰C
 Aeróbica, anaeróbica facultativa
Inserción de los genes clonados en bacteria – Células
competentes
Transformación

• E. coli competente (tratada


con ClCa choque osmótico)
• Ca en hielo
• Shock térmico
• DNA ingresa
• Se pueden clonar varios genes
• Mismo o diferente vector
7. Selección del gen recombinado
Seleccionar las bacterias transformadas– Colonias
blancas
pU19=método clásico
Cromogénico= ADN=
146 aa de la beta
-galactosidasa LasZ

inductor isopropiltio–β–
D–galactósido (IPTG)
+
IPTG 5–bromo–4–cloro–indolil
–ß–D–galactósido (Xgal)
Seleccionar las bacterias transformadas– Colonias
blancas

+
IPTG
MINI, MIDIS O MAXI PED– ADN plasmidico
• Forma básica en investigaciones en biología molecular

• Métodos para aislar ADN


Pared celular
– ADN bacteriano
Membrana 
celular

ADN 
genómico
– E. coli
ADN 
plasmídico
Centrifugación
ADN
Extracción química

1era etapa
Lisozima  Pared celular
Ruptura de la SDS  Desnaturalización de
pared celular proteínas
RNAasa  Fragmentación de RNA
Proteinasa K  Digestión de proteínas,
Nucleasas

• Fragmentos de pared celular, moléculas


pequeñas
• ADN
2da etapa
Extracción química fenol-cloroformo

El ADN plasmidico puede llevar genes de resistencia


a antibioticos
2da etapa
pH bajo
EXTRACCIÓN MEDIANTE KIT
evita el uso de fenol

pH alto

SÍLICA
RESINAS
INTERCAMBIO IÓNICO
3da etapa
Precipitación del ADN con alcoholes
Una de las técnicas mas usadas en biología
molecular
ADN  Carga (-)

Separa ADN, ARN


Electroforesis
Purifica ADN, ARN

(+) atrae (-)

• El ADN cargado
negativamente migra
hacia el polo positivo
• La carga neta hace que la
moléculas de ADN migren
independiente de su tamaño
Electroforesis de ADN en gel de agarosa
ADN  Carga (-)

Polisacárido
Agarosa
Extracto de algas
marinas

Tamiz molecular

Filtro para separara las


moléculas de acuerdo a su
tamaño y carga eléctrica
ELECTROFORESIS EN GEL
Visualización del ADN
Dejar el gel en bromuro de etidio 20 a 30 min ADN  incoloro
500 ug/ml (80 ul en 80 ml de TAE)
ADN, ARN
Bormouro
de etidio Luz UV

Al  ser  excitado  a  la  luz  UV  emite    una 


señal  que  permite  la  visualización  de 
bandas. 

Tomar una foto digital al gel de


•Obtención de proteínas para uso

terapéutico ( Insulina e interferón)

33aa
•Secuenciación del ADN (proyecto

genoma humano)

•Estudio de proteínas poco

abundantes

•Obtención de vacunas de uso

humano y animal

•Obtención de enzimas industriales


•Vacuna contra la leptospira
•Estreptoquinasa recombinante
•Eritropoyetina recombinante
•Interferón alfa recombinante
•Interferón gamma recombinante
•Factor de crecimiento epidérmico (EGF)
recombinante
•Hormona del crecimiento
•Factor XIII recombinante
•Vacuna recombinante contra la Hepatitis B
•Obtención de nuevas variedades de plantas y animales y
mejoramiento de los suelos

• Terapia génica

•Producción de microorganismos para combatir la


contaminación ambiental.
8. Procedimientos de expresión
EXPRESIÓN DE GENES CLONADOS

•Vector que contenga un promotor cerca del sitio de inserción

•Rediseño de plásmidos: promotor-operador del operón lac


VECTOR RECOMBINADO

Gen de interés
INDUCCIÓN ENZIMÁTICA: Operon lac

IPTG Inductor artificial
Allolactose:  Inductor 
Isopropil β-D-1 
natural
tiogalactopiranosido
PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA
9. Aplicaciones, riesgos y perspectivas de la
Ingeniería genética
Purificación por cromaatografia de 
afinidad en comumna de recina  
sépharose  couplée aux ions nickel et 
M PrlR M PrlR

T7lac
6 His N ter
prlR
renaturation par dialyses
250 kDa
150 kDa
100 kDa

AmpR 75 kDa

50 kDa

37 kDa
 Pet15B-prlR Hist 25 kDa PrlR
20kDa
LacI
SDS-PAGE Coloration
bleu de coomassieNitrate d’agent
M Avant Après

 Injection de lapin  pour la 
kDa Induction Induction

117
85

48 production d’anticorps 
34
26
PrlR polyclonaux dirigés contre la 
19
protéine PrlR
L’anticorps polyclonal anti-PrlR obtenu est très efficace 
et spécifique 
•Vacuna contra la leptospira
•Estreptoquinasa recombinante
•Eritropoyetina recombinante
•Interferón alfa recombinante
•Interferón gamma recombinante
•Factor de crecimiento epidérmico
(EGF) recombinante
•Hormona del crecimiento
•Factor XIII recombinante
•Vacuna recombinante contra la
Hepatitis B
EL PROYECTO GENOMA HUMANO
Se inició en 1990 previsto para el 2007,
Se terminó el 26 de Junio de 2000, con la
secuenciación de todo el genoma
humano de unos aproximadamente
30,000 genes y 3.3 mil millones de pares
de bases (pb).
PROYECTO DEL GENOMA
HUMANO
• Esta investigación científica tiene como
objetivo conocer el orden en que se disponen
los nucleotidos en la cadena del ADN
humano (determina la secuencia de pares de
bases químicas que componen el ADN) e
identificar y cartografiar (localizar los genes
en cada uno de los 23 cromosomas) los
aproximadamente 30.000 genes del genoma
humano desde un punto de vista físico y
funcional.
PROYECTO DEL GENOMA
HUMANO
• EL GENOMA HUMANO es la secuencia de ADN de
un ser humano, esta dividido en secuencias que
componen los 23 pares de cromosomas (22 pares
autosómicos y un par de cromosomas sexuales)

• Permite realizar comparaciones de genomas de


otros organismos de secuencias de bases,
organización cromosómica,
• Identificación de genes del genoma y grupos de
genes relacionados en diferentes especies.
• Determinar la secuencia de bases
ORGANIZACIÓN DEL GENOMA
HUMANO
EL GENOMA HUMANO NUCLEAR
• 23 pares de cromosomas

• 3.3 x 109 pares de bases


(3.300.000.000)

• El número total de genes


se estima en 30.000

• 50% del genoma son


secuencias repetitivas

• Eucromatina (secuencias
codificantes)

Cariotipo • Heterocromatina
(secuencias repetitivas)
PRINCIPALES HALLAZGOS DE LA
SECUENCIACIÓN DEL GENOMA
HUMANO

• Una gran proporción de genes codifican


para factores de transcripción, que regulan la
expresión de otros genes.

• Menos del 2% corresponde a la secuencia


que codifica para las proteínas

• Se desconoce la función de un 50% de los


genes descubiertos
APLICACIONES
Conocer  las  bases  moleculares  de  las  enfermedades 
hereditarias

Enf. De Akzaimer
Células falciformes
EUGENESIA
El  término  eugenesia,    proviene  del  griego  eu  (bien)  y 
génesis (comienzo), es decir “buen comienzo”, es una rama 
de la genética que busca el perfeccionamiento de la especie
humana mediante la intervención científica

Busca  e  intenta  mejorar  la  dotación  genética  de  las 


poblaciones humanas mediante la dirección científica para el 
perfeccionamiento del ser humano.
EUGENESIA
•La técnica de criogenización de semen, óvulos y embriones 
(también  aplicable  a  seres  humanos  adultos)  ha  hecho 
posible los bancos de los mismos. 

• Inseminación artificial pueden escoger semen de entre una 
gran  variedad  de  donantes  cuyas  características  fenotípicas 
pueden dar indicios de la calidad genotípica del semen.

•El punto principal   son las potenciales violaciones éticas, y 
peligrosos  efectos  en  el  uso  indebido  de  las  practicas 
eugenésicas en seres humanos
EUGENESIA: ASPECTOS POSITIVOS
• Aspectos positivos
        1.  Manipulación  de  genes  de  ciertas  personas  con 
enfermedades que pueden ser descubiertas en los chequeos 
prenatales,  eliminando  esas  enfermedades,  y  así  garantizar 
la  inclusión  social  y  mejorar  la  calidad  de  vida  del  nuevo 
individuo y su familia

2.  Se  evitaría  el  sufrimiento  físico  producido  por  algunas 


enfermedades  al  eliminarlas,  como  también  se  alargaría  la 
esperanza relativa de vida. (Por ejemplo se investiga acerca 
de la DMD –Distrofia Muscular de Duchenne, en la cual se 
podría  intervenir  a  nivel  embrionario  para  atenuar  los 
terribles efectos de la enfermedad
EUGENESIA: ASPECTOS NEGATIVOS
• Aspectos negativos

1.  Por mucho que esté avanzada, la ingeniería genética no está 
en condiciones de operar con precisión, el ADN inyectado se 
integra  en  el  genoma  del  nuevo  organismo  en  posiciones 
casuales, sin posibilidad de prever las interacciones con otros 
genes y con la fisiología del organismo. 

2. La fertilización asistida, podemos sacar aspectos positivos: 
generación  de  una  nueva  vida,  pero  también  relucen  los 
aspectos  negativos:  el  resto  de  los  embriones  que  no  son 
implantados, se  queman o se usan para investigación…. Y si, 
tenemos  como  parámetro  que  el  embrión  es  vida,  estamos 
acabando con varias vidas para generar una sola
EUGENESIA: ASPECTOS NEGATIVOS

• Aspectos negativos

• 3.  La  eugenesia  resulta  negativa  si  es  empleada  por 


satisfacción    de  gustos  personales  o  preferencias,  es  decir, 
si  como  padre  acudo  a  la  ingeniería  genética  para 
determinar el genotipo y en consecuencia el fenotipo de mi 
hijo , por ejemplo : color de ojos, pelo, etc.
TÉCNICAS DERIVADAS/ BASADAS EN
PCR
PCR Nested :Amplificación de una secuencia
dentro de otro previamente amplificada
PCR Multiplex :Varios targets diferentes en forma
simultánea
PCR-RFLP :Polimorfismo genético
RT-PCR : Detección de mRNA
Real Time PCR :Cuantificación de copias iniciales – en
tiempo real
PCR
ELEMENTOS QUIMICOS QUE SE NESECITAN

•DNA molde o templado (ADN o ADNc): contiene la región que


queremos amplificar (si es ADN genómico hablamos de PCR, si es
ADN complementario (ADNc) (ARN mensajero) de RT-PCR(reverse
transcripción-PCR) en esta la reacción es transcripción reversa.

•Enzima: (ADN polimerasa Tag–Termus aquaticus) Catalisis de la


reacción.

•Primers (sec. cortas de Oligonucleotidos) necesarias para que la


ADN polimerasa sintetice ADN (delimitan la sec. Blanco) debenser
complemetarios a cada uno de los extremos de la región a amplificar

•Desoxiribonucleotidos trifosfato: (dNTPs) dATP, dCTP, dGTP y


dTTP
•Ión magnesio: cofactor
•Solución amortiguadora o buffer
•Agua
PCR
ETAPAS
•Desnaturalización

•Hibridación

•Extensiòn

EQUIPO

•Termociclador (diseñado para establecer un


sistema homogeneo de temperatura y tiempo)
Visualización Y Análisis geles de agarosa (bufer TAE o 
TBE1X-bromuro de etidio
APLICACIONES DE LA PCR

•Expresión génica

•Genotipificación

•Detección de patógenos

•Análisis de mutaciones (defectos genéticos)

•Detección de enfermedades hereditarias

•Criminología/medicina forence (identificar personas a


travez de muestras de sangre, cabellos, por
comparacion de ADN)
Variantes de la PCR
Coloni PCR : Amplificación a partir de una colonia

PCR Nested :Amplificación de una secuencia


dentro de otra previamente amplificada (utiliza otros primers
internos específicos)

PCR Multiplex :Varios targets diferentes en forma


simultánea (varios pares de primers en forma simultanea)
PCR-RFLP :Polimorfismo genético
RT-PCR : Detección de mRNA
Real Time PCR :Cuantificación de copias iniciales – en
tiempo real
PCR NESTED (ANIDADA)
Dos rondas de amplificación con diferentes pares de primers

1 Reacción
Primers externos
para amplificación
de una secuencia
extensa

2 Reacción
Primers internos
para amplificación SEGUNDA PCR
de una región
especifica
Genera mayor ESPECIFICIDAD
PCR Multiplex

APLICACIONES
• Amplificación de varias
secuencias de forma Ensayos de deleciones
simultanea Amplifica exones
• Diferentes set de
primers Ensayos forenses
• Ojo Tamaño del Biomarcadores polimórficos
amplicon
Ensayos microbiológicos
Cepas y especies
RT-PCR RETROTRANSCRIPCIÓN
Detección de la expresión de un gen – por presencia de mRNA

mRNA
Enzima mRNA—cDNA : Retro-transcriptasa
Primers:  - Hexameros al azar
 - Oligo dT

cDNA

PCR Enzima Taq polimerasa


RT-PCR (REVERSE TRANSCRIPSIÓN
PCR ARN  cDNA
Síntesis de la 1°hebra de ADN Síntesis de la 1°hebra de ADN
RT-PCR (REVERSE TRANSCRIPSIÓN
PCR ARN  cDNA
RT-PCR Semi-cuantitativa

• Control interno para normalizar: gen 
constitutivo (eliminar errores en la 
cantidad inicial de muestra)
• PRIMERS: del gen de interés y del 
control interno.
• Cuantifica las bandas: relación 
gen/control interno
RT-PCR (REVERSE TRANSCRIPSIÓN
PCR ARN  cDNA
POLIMORFISMO ADN
     El método de análisis del DNA de grandes genomas, se basa 
en  el  análisis  del  RFLP  (Poliformismo  de  longitud  de  los 
fragmentos de restricción), tiene una aplicación idónea en la 
investigación biológica.

      
RFLPs
RESTRICTION FRAGMENT LENGTH
POLYMORPHISM
• METODOLOGIA
• Estudios de 1. Extracción de ADN
polimorfismos:
variación en la 2. PCR – se obtiene la
secuencia de ADN secuencia target

3. Digestión con
enzimas de
restricción 
mecanismo de
defensa de bacterias
CAMBIOS EN EL SITIO DE RESTRICCIÓN

Person A

5' GGCC GGCC


GGCC GGCC 3'

Person B

5' GGCC GGCC


GGTC GGCC 3'
CAMBIOS EN EL SITIO DE RESTRICCIÓN

Hae III  corta: 5’ GGCC 3’

GGCC GGCC GGCC GGCC 3'


      CC GG
      CC GG
      CC GG

GGCC GGCC GGTC GGCC 3'


      CC GG
      CC GG
ADN ADN
ADN NORMAL NORMAL SILVEST
RE
A B C

B+
C
A B C
C

ADN MUTADO
B
A A
A B+C
APLICACIONES

-Pruebas de paternidad

Identificación de personas

 Análisis de una escena del crimen
El señor de Sipán
(Lambayeque)

Estudio de restos arqueológicos
Detección del 
virus influenza
POLIMORFISMO ADN
ADN E INVESTIGACIÓN DE LA PATERNIDAD

    La mitad del genoma que una persona posee procede del 
    padre y la otra de la madre, heredándose según los 
    postulados mendelianos.

,    Se  utilizan  sondas  de  ADN  (fragmentos  de  DNA)  que 


contienen  secuencias  de  nucleótidos,  complementarias  a 
secuencias  presentes  en  loci  específicos  del  genoma 
humano. 

       
POLIMORFISMO ADN
IDENTIFICACIÓN DE CADÁVERES

También  es  posible  aplicar  la  tecnología  del 


DNA  en  el  campo  de  la  identificación  del 
cadáver  en  casos  de  grandes  catástrofes  o  en 
cuerpos  que  por  su  avanzado  estado  de 
descomposición  no  dan  resultados  concluyentes 
con otros métodos más simples. 
POLIMORFISMO ADN
DIAGNÓSTICO PARENTERAL DE
ENFERMEDADES GENÉTICAS

        Estudios  precoces,  utilizando  moléculas  de 


ADN,  nos  permiten  conseguir  una  fiabilidad 
absoluta  de  un  99,9999  %  de  probabilidad  de 
diagnosticar  enfermedades  genéticas 
( hereditarias).
CASO

Se está resolviendo el asesinato del presidente de una


compañía y se han determinado tres sospechosos:

• El jardinero de la casa, 
• La esposa del empresario 
• El vicepresidente de la compañía. 

En la escena del crimen (coche) no se han encontrado huellas 
ni en el cadáver ni en el arma homicida, sin embargo se 
encontró un mosquito cerca del cadáver que aparentemente lo 
había picado antes de su muerte

Se tomaron muestras de ADN de los tres sospechosos, del 
cadáver y del mosquito para ser analizadas.
1. Abdomen 
mosquito. 
 
2. Ala mosquito. 
 
3. Víctima. 
 
4. Jardinero. 
 
5. Mujer de la 
víctima. 
 
6. Vicepresidente. 

El asesino…..............
TINCIÓN CON BROMURO DE ETIDIO

Agente intercalante
Bromuro de Etidio
Molécula fluorescente que se
intercala entre la s bases de
la molécula de DNA

Absorción a 330 nm
(UV)emisión en luz visible
EJEMPLOS DE CORRIDOS DE
ELECTROFORESIS
Con marcador de
Con marcador de 100pb
50pb
ELECTROFORESIS
REVELADO

Separación de moléculas en un campo eléctrico


Electrodo (+)
Cámara de electroforesis
Camas para preparación del gel
de agarosa

Fuente de poder

Electrodo (-)
PCR EN TIEMPO REAL (RT-PCR)

 La técnica RT-PCR combina la amplificación del DNA con la


detección de los productos en un solo tubo.

 “Tiempo Real”: Detección de productos de PCR en la medida que


se van generando
 Monitoreando la amplificación de una secuencia especifica en
tiempo real utilizando tecnologías fluorescentes

UTILIDADES
- Genotipificación
- Cuantificación de carga viral
- Cuantificación del numero de copias
de un gen
- Expresión génica (RNA) 
Retrotranscripción
COMPONENTES RT-PCR
PCR CONVENCIONAL VS. PCR EN TIEMPO REAL

PCR
tradicional
Preparación de
Amplificación Detección
la Muestra

PCR en
Tiempo Real

Preparación de
la Muestra Amplificación y
Detección
SECUENCIACIÓN
MEZCLA DE REACCIÓN
Secuenciación de Sanger

• Reacción de PCR
• Uso de:
– Dideoxinucleotidos
– Deoxinucleotidos  dNTPs
La Reacción con ddATP
3’AATAGCATGGTACTGATCTTACGCTAT5’
5’TTATCGTA
5’TTATCGTACCA
5’TTATCGTACCATGACTAGAATGCGA
5’TTATCGTACCATGACTAGA
5’TTATCGTACCATGACTA
5’TTATCGTACCATGA

8pb
5’TTATCGTA 11pb
5’TTATCGTACCA 14pb
5’TTATCGTACCATGA 17pb
5’TTATCGTACCATGACTA 19pb
5’TTATCGTACCATGACTAGA 25pb
5’TTATCGTACCATGACTAGAATGCGA
Separación de Fragmentos
ddATP ddCTP ddGTP ddTTP

Lectura 5’ a 3’ desde la basa al tope
INTERPRETACION
DEL GEL

AGTACTTATGCAGGTC
ACGTGCA
Secuenciación automatizada
“Dye terminator”
 Marca fluorescente en cada uno de los diferentes nucleótidos: 
A, T, G y C.

 Emisión de luz a una longitud de onda especifica  Laser de 
iones de argón
Electroforesis
Capilar
LECTURAS AUTOMATIZADAS DE
LAS SECUENCIAS DE ADN

Cromatograma o electrofenograma
 - Se representa la base según color diferente
- Intensidad de la señal luminosa (altura del pico)
CITOGENETICA
Área de la Genética que estudia todo comportamiento celular, basado en el
análisis de la estructura y función de los cromosomas y el núcleo interfásico,
encaminado a establecer sus asociaciones con el desarrollo orgánico, físico y
poblacional de los organismos.
Citogenética convencional
Estructura, alteraciones cromosómicas

46, XY
Cariotipo
¿Que tipo de alteraciones se pueden estudiar?
Estructurales
Translocaciones
1- La tecnología del ADN recombinante es uno de los
hechos más sobresalientes del desarrollo de la
genética molecular.

2- El procedimiento consiste en la obtención de un gen


particular, su incorporación a un vector y su
propagación
3- Los genes pueden obtenerse por aislamiento del ADN,

aislamiento del ARNm o síntesis artificial.

4- Los vectores más empleados son los plásmidos, los


virus y los cromosomas artificiales de levadura.

5- Las aplicaciones de la ingeniería genética son muy


variadas en el campo de la medicina, la agricultura y el
saneamiento ambiental.
6- Los grandes peligros que encierra el uso de esta
tecnología, obliga a implementar y hacer cumplir
regulaciones estrictas que impidan su uso nocivo para
la humanidad.
• 7. Aunque en biología molecular existen muchas técnicas
para detección de cambios tanto a nivel del ADN como a
nivel cromosómico, el secreto esta en seleccionar la mas
adecuada dependiendo de los requerimientos y la
disponibilidad

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