Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
Facultad de Medicina
Segundo Año
de la Ingeniería genética
TEMAS ABORDADOS
Expresión de la IG y su regulación
Transcripción Traducción
Replicación
Principal
Principal mecanismo
mecanismo evolutivo
evolutivo
(explica
(explica la
la gran
gran diversidad
diversidad de
de organismos
organismos
de
de una
una especie)
especie)
RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA
Requiere la presencia de grandes segmentos de
homología entre la molécula de ADN donante y
la receptora
TRANSFORMACIÓN CONJUGACIÓN
TRANSDUCCIÓN
TRANSFORMACIÓN
Cuando
Cuando un
un virus
virus infecta
infecta aa una
una bacteria
bacteria yy el
el
ADN
ADN viral
viral se
se integra
integra al
al bacteriano
bacteriano
RECOMBINACIÓN SITIO-ESPECÍFICA
Establecimiento de la lisogenia: bacteriófago
RECOMBINACIÓN INTEGRATIVA EN EL FAGO LAMBDA
TRANSPOSICIÓN
Ha
Ha revolucionado
revolucionado elel estudio
estudio de
de la
la genética
genética de
de los
los
Eucariontes
Eucariontes yy ha
ha proporcionado
proporcionado fuentes
fuentes de
de
proteínas
proteínas específicas.
específicas.
SIGNIFICADO BIOLÓGICO DE LA RECOMBINACIÓN
Uno
Uno de
de los
los principales
principales mecanismos
mecanismos queque
intervienen
intervienen en en la
la gran
gran variabilidad
variabilidad de
de los
los
seres
seres vivos
vivos
1- La recombinación genética consiste en el intercambio
de grandes segmentos entre dos moléculas de ADN.
las dañinas.
3. Procedimiento general de clonación
CLONACIÓN
• La clonación es el proceso por el que se
consiguen un duplicado genético, muchas
copias idénticas de un mismo segmento
gen (clones) u organismo
transformación
hospedador
(bacteria)
La Clonación se basada en la transferencia nuclear, en la
que participan dos células; la del individuo donante (su
material genético) y la que lo acepta.
TIPOS DE CLONACIÓN
Terapéutica ( transplantes)
Reproductiva
APLICACIONES DE LA CLONACIÓN
INVESTIGACIÓN APLICACIONES
CLONAR
FABRICAR VACAS,
FRENAR EL APLICACIONES
TEJIDOS U CABRAS Y
ENVEJECIMIENTO TERAPEUTICAS
ORGANOS OBEJAS
A PARTIR DE
COMBATIR A PARTIR DE
ENFERMEDADES
DETECCIÓN Y CELULULAS
MADRE LECHE PURA
TRATAMIENTO
PARA CON
CLONAR COMBATIR EL
ESPECIES Transplantes CANCER PROTEÍNAS
DESAPARECIDAS HUMANAS
POR QUÉ ES POSIBLE LA CLOANACIÓN?
Permitiría posibilidades de
manipulación genética.
Las células en cultivo son un material
muy adecuado para introducir o
eliminar determinados genes y se
ampliarían mucho las posibles
modificaciones genéticas que las
técnicas actuales no permiten.
CLONACIÓN ANIMAL
• Por clonación animal, han sido clonados
varios animales como ranas, ratones, ratas,
yeguas, cerdos, etc.
• La clonación animal más famosa fue la
clonación de la oveja Dolly.
• Desde el punto de vista técnico, los animales
clonados también han presentado problemas:
además de presentar un porcentaje mayor de
malformaciones, padecen con frecuencia un
síndrome que se manifiesta en que su tamaño
es mayor de lo normal, y que tiene
consecuencias negativas para su salud y
desarrollo.
CLONACIÓN DESDE EL PUNTO DE
VISTA RELIGIOSO
• Tras la intervención realizada por los científicos
Ian Wilmut y Keith Campbell en la Oveja Dolly,
el Vaticano publicó un documento titulado
Reflexiones sobre la clonación.
• La Iglesia católica sostiene la teoría de que
permitir la clonación humana implicaría una
violación de los principios fundamentales de
los derechos del hombre: la igualdad entre los
seres humanos y la no discriminación.
4. Obtención de genes específicos
Métodos para la obtención de genes
expresión de la IG
Transcripción Traducción
Replicación
Retrotranscripción
REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)
• La reacción en cadena de la polimerasa se usa para amplificar
por síntesis un segmento limitado de DNA del cual se conoce la
secuencia en los extremos. La técnica que consiste en replicar una
secuencia de una cadena de DNA hasta infinitas veces.
REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)
Componenentes: Muestra de ADN
Diseño de los cebadores
DNA Polimerasa
Deoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) dATP, dGTP,
dCTP y dTTP
Tampón de la reacción
5. Recombinación in vitro
1. VECTORES
2. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
3. ADN LIGASA
Molécula de ADN que se utiliza para introducir el gen
en una célula
1.
1. Capaz
Capaz de
de replicarse
replicarse
2.
2. Procedimiento
Procedimiento dede detección
detección
3.
3. Introducción
Introducción en
en una
una célula
célula
TIPOS DE VECTORES
1. PLÁSMIDOS BACTERIANOS
2. VIRUS (BACTERIÓFAGOS)
Contienen
Contienen genes
genes esenciales
esenciales para
para la
la
supervivencia
supervivencia en
en determinados
determinados medios
medios
(acomodan
(acomodan los
los genes
genes más
más pequeños)
pequeños)
PLÁSMIDOS BACTERIANOS
ADN doble hebra, circular
Tamaño 1-200 kb
Replicación autónoma
Acomodan
Acomodan genes
genes de
de gran
gran tamaño
tamaño
• Insertos de 45 kb
• Infecta E. coli
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
la «R» en RFLP
Aisladas a partir de bacterias, las usan como una forma
de sistema molecular para destruir (digerir) el ADN.
Extremos
romos
Extremos
cohesivos
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
la «R» en RFLP
Endonucleasas.
Exonucleasas.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Región especifica
(sitio de Enzimas de No Cortan
reconocimiento) Restricción su DNA
metilasas
metilasas endonucleasas
endonucleasas
SAM
SAH
Protector de modificación (metilación) proteje
Protector de modificación (metilación) proteje
su propio ADN
Infección
Infección vírica
vírica Transferencia
Transferencia directa
directa
Métodos
Métodos Químicos
Químicos Métodos
Métodos Físicos
Físicos
•Lipofección •Electroporación
•DEAE-dextrano •Choque térmico
•Cloruro de calcio • Microinyección
• Diferentes cepas por sus genotipos
(DH5α; DH10B, JM109).
• Muy transformable
• Usualmente inofensiva
Excepto E. coli O157:H7
Diarrea
• Ventajas:
Crecimiento rápido
Crecimiento controlado
Medio mineral con fuente de C
Crecen en medio líquido, sólido
Fácil conservación 4 ⁰C, -70 ⁰C
Aeróbica, anaeróbica facultativa
Inserción de los genes clonados en bacteria – Células
competentes
Transformación
inductor isopropiltio–β–
D–galactósido (IPTG)
+
IPTG 5–bromo–4–cloro–indolil
–ß–D–galactósido (Xgal)
Seleccionar las bacterias transformadas– Colonias
blancas
+
IPTG
MINI, MIDIS O MAXI PED– ADN plasmidico
• Forma básica en investigaciones en biología molecular
ADN
genómico
– E. coli
ADN
plasmídico
Centrifugación
ADN
Extracción química
1era etapa
Lisozima Pared celular
Ruptura de la SDS Desnaturalización de
pared celular proteínas
RNAasa Fragmentación de RNA
Proteinasa K Digestión de proteínas,
Nucleasas
pH alto
SÍLICA
RESINAS
INTERCAMBIO IÓNICO
3da etapa
Precipitación del ADN con alcoholes
Una de las técnicas mas usadas en biología
molecular
ADN Carga (-)
• El ADN cargado
negativamente migra
hacia el polo positivo
• La carga neta hace que la
moléculas de ADN migren
independiente de su tamaño
Electroforesis de ADN en gel de agarosa
ADN Carga (-)
Polisacárido
Agarosa
Extracto de algas
marinas
Tamiz molecular
33aa
•Secuenciación del ADN (proyecto
genoma humano)
abundantes
humano y animal
• Terapia génica
Gen de interés
INDUCCIÓN ENZIMÁTICA: Operon lac
IPTG Inductor artificial
Allolactose: Inductor
Isopropil β-D-1
natural
tiogalactopiranosido
PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA
9. Aplicaciones, riesgos y perspectivas de la
Ingeniería genética
Purificación por cromaatografia de
afinidad en comumna de recina
sépharose couplée aux ions nickel et
M PrlR M PrlR
T7lac
6 His N ter
prlR
renaturation par dialyses
250 kDa
150 kDa
100 kDa
AmpR 75 kDa
50 kDa
37 kDa
Pet15B-prlR Hist 25 kDa PrlR
20kDa
LacI
SDS-PAGE Coloration
bleu de coomassieNitrate d’agent
M Avant Après
Injection de lapin pour la
kDa Induction Induction
117
85
48 production d’anticorps
34
26
PrlR polyclonaux dirigés contre la
19
protéine PrlR
L’anticorps polyclonal anti-PrlR obtenu est très efficace
et spécifique
•Vacuna contra la leptospira
•Estreptoquinasa recombinante
•Eritropoyetina recombinante
•Interferón alfa recombinante
•Interferón gamma recombinante
•Factor de crecimiento epidérmico
(EGF) recombinante
•Hormona del crecimiento
•Factor XIII recombinante
•Vacuna recombinante contra la
Hepatitis B
EL PROYECTO GENOMA HUMANO
Se inició en 1990 previsto para el 2007,
Se terminó el 26 de Junio de 2000, con la
secuenciación de todo el genoma
humano de unos aproximadamente
30,000 genes y 3.3 mil millones de pares
de bases (pb).
PROYECTO DEL GENOMA
HUMANO
• Esta investigación científica tiene como
objetivo conocer el orden en que se disponen
los nucleotidos en la cadena del ADN
humano (determina la secuencia de pares de
bases químicas que componen el ADN) e
identificar y cartografiar (localizar los genes
en cada uno de los 23 cromosomas) los
aproximadamente 30.000 genes del genoma
humano desde un punto de vista físico y
funcional.
PROYECTO DEL GENOMA
HUMANO
• EL GENOMA HUMANO es la secuencia de ADN de
un ser humano, esta dividido en secuencias que
componen los 23 pares de cromosomas (22 pares
autosómicos y un par de cromosomas sexuales)
• Eucromatina (secuencias
codificantes)
Cariotipo • Heterocromatina
(secuencias repetitivas)
PRINCIPALES HALLAZGOS DE LA
SECUENCIACIÓN DEL GENOMA
HUMANO
Enf. De Akzaimer
Células falciformes
EUGENESIA
El término eugenesia, proviene del griego eu (bien) y
génesis (comienzo), es decir “buen comienzo”, es una rama
de la genética que busca el perfeccionamiento de la especie
humana mediante la intervención científica
• Inseminación artificial pueden escoger semen de entre una
gran variedad de donantes cuyas características fenotípicas
pueden dar indicios de la calidad genotípica del semen.
•El punto principal son las potenciales violaciones éticas, y
peligrosos efectos en el uso indebido de las practicas
eugenésicas en seres humanos
EUGENESIA: ASPECTOS POSITIVOS
• Aspectos positivos
1. Manipulación de genes de ciertas personas con
enfermedades que pueden ser descubiertas en los chequeos
prenatales, eliminando esas enfermedades, y así garantizar
la inclusión social y mejorar la calidad de vida del nuevo
individuo y su familia
• Aspectos negativos
•Hibridación
•Extensiòn
EQUIPO
•Expresión génica
•Genotipificación
•Detección de patógenos
1 Reacción
Primers externos
para amplificación
de una secuencia
extensa
2 Reacción
Primers internos
para amplificación SEGUNDA PCR
de una región
especifica
Genera mayor ESPECIFICIDAD
PCR Multiplex
APLICACIONES
• Amplificación de varias
secuencias de forma Ensayos de deleciones
simultanea Amplifica exones
• Diferentes set de
primers Ensayos forenses
• Ojo Tamaño del Biomarcadores polimórficos
amplicon
Ensayos microbiológicos
Cepas y especies
RT-PCR RETROTRANSCRIPCIÓN
Detección de la expresión de un gen – por presencia de mRNA
mRNA
Enzima mRNA—cDNA : Retro-transcriptasa
Primers: - Hexameros al azar
- Oligo dT
cDNA
• Control interno para normalizar: gen
constitutivo (eliminar errores en la
cantidad inicial de muestra)
• PRIMERS: del gen de interés y del
control interno.
• Cuantifica las bandas: relación
gen/control interno
RT-PCR (REVERSE TRANSCRIPSIÓN
PCR ARN cDNA
POLIMORFISMO ADN
El método de análisis del DNA de grandes genomas, se basa
en el análisis del RFLP (Poliformismo de longitud de los
fragmentos de restricción), tiene una aplicación idónea en la
investigación biológica.
RFLPs
RESTRICTION FRAGMENT LENGTH
POLYMORPHISM
• METODOLOGIA
• Estudios de 1. Extracción de ADN
polimorfismos:
variación en la 2. PCR – se obtiene la
secuencia de ADN secuencia target
3. Digestión con
enzimas de
restricción
mecanismo de
defensa de bacterias
CAMBIOS EN EL SITIO DE RESTRICCIÓN
Person A
Person B
B+
C
A B C
C
ADN MUTADO
B
A A
A B+C
APLICACIONES
-Pruebas de paternidad
Identificación de personas
Análisis de una escena del crimen
El señor de Sipán
(Lambayeque)
Estudio de restos arqueológicos
Detección del
virus influenza
POLIMORFISMO ADN
ADN E INVESTIGACIÓN DE LA PATERNIDAD
La mitad del genoma que una persona posee procede del
padre y la otra de la madre, heredándose según los
postulados mendelianos.
POLIMORFISMO ADN
IDENTIFICACIÓN DE CADÁVERES
• El jardinero de la casa,
• La esposa del empresario
• El vicepresidente de la compañía.
En la escena del crimen (coche) no se han encontrado huellas
ni en el cadáver ni en el arma homicida, sin embargo se
encontró un mosquito cerca del cadáver que aparentemente lo
había picado antes de su muerte
Se tomaron muestras de ADN de los tres sospechosos, del
cadáver y del mosquito para ser analizadas.
1. Abdomen
mosquito.
2. Ala mosquito.
3. Víctima.
4. Jardinero.
5. Mujer de la
víctima.
6. Vicepresidente.
El asesino…..............
TINCIÓN CON BROMURO DE ETIDIO
Agente intercalante
Bromuro de Etidio
Molécula fluorescente que se
intercala entre la s bases de
la molécula de DNA
Absorción a 330 nm
(UV)emisión en luz visible
EJEMPLOS DE CORRIDOS DE
ELECTROFORESIS
Con marcador de
Con marcador de 100pb
50pb
ELECTROFORESIS
REVELADO
Fuente de poder
Electrodo (-)
PCR EN TIEMPO REAL (RT-PCR)
UTILIDADES
- Genotipificación
- Cuantificación de carga viral
- Cuantificación del numero de copias
de un gen
- Expresión génica (RNA)
Retrotranscripción
COMPONENTES RT-PCR
PCR CONVENCIONAL VS. PCR EN TIEMPO REAL
PCR
tradicional
Preparación de
Amplificación Detección
la Muestra
PCR en
Tiempo Real
Preparación de
la Muestra Amplificación y
Detección
SECUENCIACIÓN
MEZCLA DE REACCIÓN
Secuenciación de Sanger
• Reacción de PCR
• Uso de:
– Dideoxinucleotidos
– Deoxinucleotidos dNTPs
La Reacción con ddATP
3’AATAGCATGGTACTGATCTTACGCTAT5’
5’TTATCGTA
5’TTATCGTACCA
5’TTATCGTACCATGACTAGAATGCGA
5’TTATCGTACCATGACTAGA
5’TTATCGTACCATGACTA
5’TTATCGTACCATGA
8pb
5’TTATCGTA 11pb
5’TTATCGTACCA 14pb
5’TTATCGTACCATGA 17pb
5’TTATCGTACCATGACTA 19pb
5’TTATCGTACCATGACTAGA 25pb
5’TTATCGTACCATGACTAGAATGCGA
Separación de Fragmentos
ddATP ddCTP ddGTP ddTTP
Lectura 5’ a 3’ desde la basa al tope
INTERPRETACION
DEL GEL
AGTACTTATGCAGGTC
ACGTGCA
Secuenciación automatizada
“Dye terminator”
Marca fluorescente en cada uno de los diferentes nucleótidos:
A, T, G y C.
Emisión de luz a una longitud de onda especifica Laser de
iones de argón
Electroforesis
Capilar
LECTURAS AUTOMATIZADAS DE
LAS SECUENCIAS DE ADN
Cromatograma o electrofenograma
- Se representa la base según color diferente
- Intensidad de la señal luminosa (altura del pico)
CITOGENETICA
Área de la Genética que estudia todo comportamiento celular, basado en el
análisis de la estructura y función de los cromosomas y el núcleo interfásico,
encaminado a establecer sus asociaciones con el desarrollo orgánico, físico y
poblacional de los organismos.
Citogenética convencional
Estructura, alteraciones cromosómicas
46, XY
Cariotipo
¿Que tipo de alteraciones se pueden estudiar?
Estructurales
Translocaciones
1- La tecnología del ADN recombinante es uno de los
hechos más sobresalientes del desarrollo de la
genética molecular.