UNIVERSIDAD DE CUENCA

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y
ZOOTECNIA
TEMA:

“ANTIBODY RESPONSES TO ANTIGENIC

DETERMINANTS OF INFLUENZA VIRUS
HEMAGGLUTININ.”
AUTORES:

CARREÑO, GOMEZCOELLO, GONZÁLEZ, QUIZHPI,

RAMÓN, A.

CUENCA, SEPTIEMBRE DEL 2017.

 INTRODUCCIÓN
 La cooperación entre los linfocitos derivados del timo (T) y derivados de la médula ósea (B)
es necesaria para la secreción óptima de anticuerpos a los antígenos dependientes del timo .
 Sin embargo, poco se sabe sobre qué fase de la respuesta humoral se bloquea cuando el
ayudante del efecto de las células T es insuficiente.

 Se ha investigado el papel de la cooperación de linfocitos T en la respuesta

humoral de ratones a la hemaglutinina purificada (HA) extraída del virus de la
influenza.
o Los resultados sugieren que el efecto auxiliar de células T es requerido para la secreción
de anticuerpo a HA, pero no para el desarrollo de memoria específica en la célula B de
linaje.
o La memoria de linfocitos B pueden ser transferidos de un animal a otro y puede ser
heteróloga, de reacción cruzada HA, siendo así responsable del fenómeno de "pecado
original antigénico".
 Materiales y métodos
 Virus
Preparaciones concentradas y purificadas del cultivo de huevo virus Influenza A se obtuvieron como se ha descrito
anteriormente a partir de las siguientes cepas:
 A / BEL / 43 (HON1) y A / PR8 / 34 (HON1)
 A / FM1 / 47 (H1N1) tiene H1, conocido por estar relacionado con Ho
 A / Hong-Kong / 1/68 (H3N2) tiene Ha que no está relacionado con Ho y HI

 Hemaglutinina

Primer conjunto de experimentos

 Ho se extrajo de A / BEL por disrupción del virus con el detergente dodecilsulfato sódico y
separación en tiras de acetato de celulosa

Segundo conjunto de experimentos

 Ho, HI y Ha se obtuvieron por tratamiento del virus respectivo con la enzima proteolítica
bromelina y separación en la centrifugación de sacarosa.
 RATONES
• Se usaron ratones machos consanguíneos de la cepa CBA, 6-8 semanas de edad.
• Para obtener timo-privados (TXBM) ratones, los animales fueron ticmotizados a las 6 semanas de edad,
irradiados letalmente (900 R) 15-21 días después de la timectomía y de inmediato reconstituido con 6-
8 × 108 células de médula ósea singénica.
• En los ratones que se encontraron tímica en el examen post mortem al final de los experimentos
fueron descartados.

 INMUNIZACIÓN

• Los ratones se inocularon por vía intraperitoneal (ip) con HA diluido en solución salina
tamponada con fosfato, sin adyuvante.
• Los sueros se obtuvieron del sangrado de la cola y almacenado a -20 ° C.
 CÉLULAS DEL TIMO
• Se eliminaron los timos de ratones CBA viejos de 6 semanas.
• Las suspensiones unicelulares se obtuvieron forzando suavemente a través de
un tamiz de acero inoxidable
• Se lavaron y se resuspendieron en un medio L15.

 MEDICIÓN DE ANTICUERPOS.
• Método de inmunodifusión radial simple (SRDT)

• Preparaciones concentradas purificadas del virus de la influenza se mezclaron en agarosa a una

concentración final de 0,15 mg de proteínas virales por ml de agarosa.

 PRUEBAS DE ABSORCIÓN
• Mezclar volúmenes iguales de antisuero y una preparación concentrada purificada
(5 mg de proteína por ml) o solución salina (control de la dilución) y probando la mezcla en SRDT
 RESULTADOS
 Caracterización de dos grupos de determinantes antigénicos en la Molécula HA
y de sus respectivas poblaciones de anticuerpos. Se criaron antisueros en
conejos usando antígenos Ho y H1 extraídos con bromelina y se ensayaron en
placas de difusión inmunodulable contra la influenza disgregada por detergente
A / PR8, A / FM1 y A / Hong-Kong / 68.
 Las Figuras 1 y 2 muestran que, con cada antisuero, se obtuvo una reacción de
precipitación frente a A / PR8 y A / FM1, con espolones típicos que indican la
reactividad cruzada. Cuando el anti-Ho se absorbió el suero con un volumen
igual de virus A / FM1 concentrado purificado y ultracentrifugado, la población
de anticuerpos sobrenadante reaccionó sólo con A / PR8 HA (Figura 3).
RESULTADOS
 RESULTADOS
 La población de anticuerpos de la absorción A / FM1 virus por un tampón de ácido de baja
molaridad reaccionado con A / AH1 y A / PR8 HA (Fig. 4). El A / Hong-Kong / 68 HA no
relacionado no dio ninguna reacción. Estos resultados indican que el S. inmunológico
reconoce al menos dos antígenos determinantes dentro de la molécula de HA, y responde
haciendo dos poblaciones distintas de anticuerpos. Uno de ellos es específico para parte de
la molécula de HA que es común a Ho y H1 (reacción cruzada población = CR), y otro es
específico de la cepa. EL resultado fue apoyado por los resultados de cruce-absorción en
experimentos en SRDT.
 Anti-HA suero dio zonas de opalescencia en inmunoplacas que contienen el virus homólogo,
y zonas más pequeñas en placas que contienen la misma cantidad de virus heterólogo. La
Fig. 5 muestra que la absorción de un suero anti-HA con el virus homólogo es completa, la
absorción con el virus heterólogo no reduce el tamaño de la zona. Dos poblaciones de
anticuerpos reaccionan en SRDT. Las cepas específicas de la población es la más abundante
y determina el tamaño de la zona.
 La zona CR, tiene una especificidad diferente, no interfiere con la zona específica de la
cepa. La ventaja de las pruebas de absorción cruzada es que permiten una cuantificación
de cada población de anticuerpos. La potencia de la población CR es el área de la zona
obtenida en una placa SRDT que contiene el virus heterólogo, que es absorbido por la
incubación previa con el virus homólogo. La potencia de la población específica de la cepa
es el área de la zona obtenida en una placa que contiene el virus homólogo, que no es
absorbida por la proteína heteróloga del virus.
RESULTADOS
FORMACIÓN DE ANTICUERPOS
DEPENDIENTES DEL TIMO Y SU
SUSTITUCIÓN MEDIANTE
ADMINISTRACIÓN REPETIDA DE
ANTÍGENOS.
 Los ratones T + y TXBM se inmunizaron
mediante diluciones graduadas de Ho extraído
con detergente.
La Fig. 6 muestra una diferencia
sorprendente entre los animales T + :
respuesta dependiente de la dosis bien
definida.

Ratones TXBM: no mostraban respuesta

en absoluto incluso cuando se inyectaban
con el antígeno no diluido
La fuerte dependencia del timo en la
formación de anticuerpos podría ser
superada por una tercera inyección de
10 micro g de Ho

La secreción de anticuerpos de
ratones TXBM se retrasó mucho
cuando se comparó con la respuesta
humoral normal de los controles.
 Reconstitución inmunológica de ratones
privados de timo cebado.

 Estos ratones cebados, pero no secretores de anticuerpos, se reconstituyeron

con timocitos y se aumentaron con Ho.
 La respuesta de anticuerpos en la población de CR fue paradójicamente
menor en animales reconstituidos que en animales no reconstituidos.
 Se observó una respuesta de anticuerpos fuerte, de tipo secundario So en
animales reconstituidos: memoria inmunológica antes de la reconstitución
 La Fig. 8 muestra que el desarrollo de la memoria fue incluso mejor en TXBM
que en animales intactos
 Discusión
 Las pruebas de absorción de anticuerpos descritas en este documento
sugieren fuertemente la existencia en la molécula HA de dos determinantes
antigénicos distintos o grupos de determinantes.
 Inmunológicamente ratones intactos y conejos inmunizados con Ho, producen
en nuestro experimento dos poblaciones de anticuerpos que corresponden a
los determinantes antigénicos de la molécula específicos de la cepa
(anticuerpo So) y reactivos cruzados (anticuerpos de CR).
 La medición independiente de ambas poblaciones indica que la población de
anticuerpos So es más abundante que la población de CR, implicando que el
determinante específico de la cepa de Ho es más inmunogénico que el
reactivo cruzado determinante.
 Los resultados descritos en este documento demuestran una fuerte
dependencia del timo de la formación de anticuerpos contra HA.
 Tabla II
Respuestas de anticuerpos anti- HO de ratones privados de timo cebado después de la
reconstitución inmunológico con timocitos
Ratones Reconstituci Estímulo de Ab respuesta en la placa que contiene A / Ab respuesta en la placa que contiene
receptores ón por antígenos PR8 virus (Población de anticuerpos So) A / FM1 virus (Población de anticuerpos
timocitos CR)
desde
donantes Significado del área zonal Absorción Significado del área zonal Absorción
normales** por A/ FM1 por A/
Día 0 Día 7 virus en el Día 0 Día 7 PR8 virus
día 7 en el día 7

% %

TXBM + HO 0 0 0 0

TXBM cebado + SRBC 0 0 0 0

con HO*

TXBM cebado
- HO 0 2.5 0 0 12.6 100
con HO
(0-4.4)||
(4.0-35.5)
TXBM cebado
con HO + HO 0 10.8 0 0 100
(4.4-25.1) 2.0
(0-3.9)
 Resumen
 Usando métodos de inmunodifusión, se ha demostrado que la hemaglutinina
purificada (HA) extraída de dos cepas relacionadas de virus influenza A (A / PR8 /
34 y A / FM1 / 47) tienen dos determinantes antigénicos distintos o grupos de
determinantes. Un determinante es la reacción cruzada mientras que el otro es
específico de la cepa.
 antisueros elevados en ratones normales contra HA contenían dos poblaciones de
moléculas de anticuerpo, cada una dirigida contra uno de los determinantes. La
inmunización de ratones privados de timo (TXBM) mostró una fuerte dependencia
del timo de la formación de anticuerpos a HA. Sin embargo, la dependencia del
timo de la formación de anticuerpos contra el determinante reactivo cruzado
podría ser superada por inoculaciones repetidas de HA en ratones TXBM, lo que
indica una manipulación diferente de dos porciones de la misma molécula por el
sistema inmunológico.
BIBLIOGRAFÍA:

 JEAN-LOUIS VIRELIZIER,* ROY POSTLETHWAITE,$ GEOFFREY C. SCHILD, AND

ANTHONY C. ALLISON. (1974). ANTIBODY RESPONSES TO ANTIGENIC
DETERMINANTS OF INFLUENZA VIRUS HEMAGGLUTININ. Recuperado de
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2139740/pdf/1559.pdf