MÉTODOS BIOQUÍMICOS

ESPECTROSCOPIA
INTERACCIÓN RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA - MATERIA
 ESPECTROFOTOMETRÍA

Técnica analítica que permite identificar

sustancias y determinar la concentración de
dicho compuesto en solución

Estudia la interacción de la radiación

electromagnética con la materia

La cantidad de luz absorbida depende de

forma lineal de la concentración

• Método científico utilizado para medir la cantidad de energía

radiante (luz) que absorbe una sustancia química, en función de
la longitud de onda de la radiación; midiendo la intensidad de la
luz cuando un haz luminoso pasa a través de la solución muestra,
basándose en la Ley de Beer-Lambert
 ESPECTROFOTOMETRÍA

• Determina la concentración de una sustancia,

valiéndose de la capacidad de absorber la luz a
determinadas longitudes de onda.
• Este método emplea una fuente de radiación:

La cantidad de luz
absorbida es
directamente
proporcional a la
concentración de la
sustancia
• La luz, considerada como onda, consiste en un
campo magnético y un campo eléctrico
perpendiculares entre sí. El haz de luz es un flujo de
fotones a diferentes longitudes de onda

• Cuando una de estas ondas encuentra una

molécula, puede ser dispersada (alterada su
dirección de propagación) o bien absorbida (su
energía se transfiere a la molécula), la probabilidad
de estos sucesos, depende de las propiedades de
la molécula.
ESPECTRO DE ABSORCIÓN
ESPECTROFOTOMETRÍA
 ESPECTROFOTOMETRÍA

• Fotocolorimetría:
Solo utiliza el espectro de luz visible

Ley de Bourguer-Lambert-
Beer o ley general de la
espectrofotometría :
Io permite hallar la
concentración de una
especie química a partir de la
It
medida de la intensidad de
luz absorbida por la muestra.

-Abs
Lectura de It/Io = 10
absorbancia o
densidad óptica
 Cuando un haz de luz atraviesa un medio absorbente de espesor
constante, la cantidad de energía luminosa absorbida por el medio varia
en forma directamente proporcional a la concentración del absorbente en
el medio
 ESPECTROFOTOMETRÍA

• La relación It / I0 se conoce como transmitancia, T.

• T = It / Io
• Log It/Io=-kLC
• -Log It/Io= kLC
• -Log T= kLC
• -Log T = Absorbancia o densidad
óptica. L=1 cm

• Ab= kC
 ESPECTROFOTOMETRÍA

La solución estándar,
contiene una
concentración
conocida de la
sustancia que se
esta midiendo.

Abst=kCst

AbX=kCx

La relación
AbX kCx Cst/Abst= factor de
CX = Cst x AbX
Abst kCst calibración .
Abst
CX=Fc x AbX
 ESPECTROFOTOMETRÍA

• Curva de calibración: también permite calcular la

CX.
• Se utiliza cuando son varias soluciones estándar.
• Cuyas concentraciones son conocidas.
• Cuyas absorbancias se miden con el fotocolorímetro
o espectrofotómetro.

Coeficiente de extinción molar= tang. a

a
 ESPECTROFOTOMETRÍA

• Utilidad:

Identificar una
sustancia.
Concentracion
de las
sustancias.

https://www.youtube.com/watch?v=fX
jP10sdmQU
 ELECTROFORESIS
SIGNIFICA MOVER CON ELECTRICIDAD
 ELECTROFORESIS

• Transporte de partículas que poseen carga eléctrica a

través de un disolvente mediante un campo eléctrico.
 ELECTROFORESIS
• Utilidad: caracterizar una macromolécula
mediante la determinación de la velocidad con
que se mueve en el campo eléctrico.
Calcular el peso molecular de una proteína

Distinguir moléculas por su carga neta o su forma

Detectar cambios enaa, de restos polares o no

polares.

Para separar cuantitativamente distintas especies

moleculares.
 Componentes:

• Fuente de
alimentación
ELECTROFORESI
S
• Dos electrodos:
• Ánodo (+)
• Cátodo (-)

• Tampón de
electroforesis

• Soporte
electroforético
 ELECTROFORESIS
La velocidad de migración es:

Inversamente
proporcional al tamaño
de la molécula.

Inversamente proporcional a la
viscosidad del medio.

Proporcional a la fuerza
aplicada al campo.

Proporcional a la
carga neta de la
molécula
Inversamente proporcional al
coeficiente de fricción
 ELECTROFORESIS
PARÁMETROS QUE INFLUYEN EN LA MOVILIDAD
ELECTROFORÉTICA:
• Parámetros externos
• Campo eléctrico
• Temperatura
• Parámetros relacionados con el solvente y con el
sistema electroforético
• Viscosidad
• Fuerza iónica
• La naturaleza de los iones componentes
• El pH
• Parámetros relacionados con el soluto
• La carga
• La forma y
• tamaño de los iones
 TIPOS DE ELECTROFORESIS

La muestra se aplica como

Los componentes de la muestra
•Las macromoléculas
están presentes en toda la
•Launadisolución a tratar
mancha o banda y susse La muestra
•La muestra se
se aplica
están dispersas
disolución en toda
y se determina aplica como
componentes migran a
también en una zona
través de un disolvente,
unamancha, o banda,
aplica también en
la disolución y sedel frente
ópticamente la posición
pero se
de avance o frontera con el
muevendisolvente.
en
utilizando además un medio
y las
quepartículas
da soporte a migran
éste. En a
una zona, pero se
añadecontinuamentea
formalibreen el medio. través
este casodenoun disolvente,
se determina la suministra
lo largo del proceso
utilizando unque el único
movilidad, sino
continuamente a lo
objetivo de la técnica es
mediosoporte(papel
separar los componentes de
o largo del proceso.
ciertos tipos de geles)
la muestra.

De frente
Zonal Continua
móvil
ELECTROFORESIS DE FRENTE MÓVIL

• Las sustancias a separar se

introducen en un tubo en
forma de U, disueltas en un
tampón de pH y fuerza
iónica adecuados.
• Se colocan los electrodos
en sendos brazos del
dispositivo, entre los que se Determinación
crea un campo eléctrico, de la movilidad
provocando que las y punto
moléculas (por ejemplo: isoeléctrico de
proteínas) cargadas las proteínas.
emigren hacia los
electrodos de polaridad Poca utilidad
opuesta. de la
determinación
• Su posición se determina cuantitativa de
en función del tiempo por la movilidad.
óptica de Schlieren.
 ELECTROFORESIS ZONAL

• Se coloca una mancha o fina capa de muestra en

contacto con un medio semisólido o gelatinoso, se
aplica un campo eléctrico y las partículas migran a
través del soporte.

Se utilizan pequeñas
cantidades de muestra. El medio de soporte
absorbe algunas veces,
Soporte: evita las varias de las especies
perturbaciones moleculares.
mecánicas y las
corrientes de Actúa como tamiz
convección por molecular,
cambios deT°o por la contribuyendo también
densidad de la a la separación.
disolución.
 ELECTROFORESIS ZONAL
Desventajas:
• En papel:
 Si el papel es fino, se
BAJO VOLTAJE

puede desgarrar con

20 V/cm. 200 V/cm, la facilidad.
Utilidad: para el velocidad de  Si el papel es grueso, las
análisis de separación
aumenta. bandas se distorsionan.
mezclas
proteicas. Utilidad: para la  Se produce interacción

ALTO VOLTAJE
separación entre las proteínas y los
deaay péptidos. grupos hidroxilos de la
celulosa del papel, por lo
tanto la migración se
frena.
 Calidad del papel: 90% de
celulosa absorción de
agua y conductividad
eléctrica.
 Efecto electro osmótico
ánodo-cátodo
 ELECTROFORESIS ZONAL

• En tiras de acetato de celulosa: La mayor parte

de los grupos
hidroxilo de la
celulosa están
esterificados con
residuos acetato

No hay
interacción
con las
proteínas.
 ELECTROFORESIS ZONAL

• En gel:
 Técnica barata,
Almidón fácil y rápida

 Útil para proteínas y pequeñas

moléculas de RNA.
 Mejor efecto como tamiz
molecular.
 Proporciona control del tamaño de
Poliacrilamida sus poros utilizando
concentraciones distintas de
monómeros
 Presenta adsorción despreciable
de proteínas.
 De alta resolución.
 Sus componentes son tóxicos

 Buena resolución.
 Separación de moléculas
Agarosa grandes con r>5-10 nm
(virus. Ac. Nucleicos.
Lipoproteínas.
 ELECTROFORESIS ZONAL

• En gel:
• Electroforesis en geles con SDS

• Los pesos moleculares de la mayoría de las proteínas pueden

ser determinados midiendo la movilidad en geles de
poliacrilamida con el detergente dodecilsulfato sódico (SDS).

• Las proteínas multicatenarias se unen al SDS y se disocian, por lo

que se pierde su estructura secundaria.
 ELECTROFORESIS

• Aplicación:
 CROMATOGRAFÍA
SEPARACIÓN DE LOS
COMPONENTES DE UNA MEZCLA DEBIDO A LA INFLUENCIA DE DOS EFECTOS
CONTRAPUESTOS
 CROMATOGRAFÍA
Retención.Efecto producido
sobre los componentes de la
mezcla por unafase
estacionaria, que puede ser
un sólido o un líquido anclado
a un soporte sólido

Desplazamiento.Efecto
ejercido sobre los
componentes de la mezcla
por unafase móvil, que
puede ser un líquido o un
gas.
 CROMATOGRAFÍA
Según la naturaleza de la Según la interacción entre
fase estacionaria y de la la mezcla, la fase móvil y
fase móvil estacionaria

• C. sólido-líquido. La fase
estacionaria es un sólido y la • Cromatografía de
móvil un líquido.
adsorción.
• C. líquido-líquido. La fase
estacionaria es un líquido
anclado a un soporte sólido.
• Cromatografía de
• C. líquido-gas. La fase partición.
estacionaria es un líquido no
volátil impregnado en un sólido
y la fase móvil es un gas.
• Cromatografía de
• C. sólido-gas. La fase intercambio iónico.
estacionaria es un sólido y la
móvil un gas.
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

Separación por
adsorción/desorción La fase estacionaria es un
sólido polar capaz de
adsorber a los
componentes de la mezcla
mediante interacciones de
tipo polar.
Fase estacionaria Sustancias que separan
Alúmina Moléculas orgánicas
pequeñas, proteínas
Gel de sílice Esteroles, aa, lípidos
Carbón activado Péptidos, aa, azucares
Fosfato de calcio Proteínas, poli
nucleótidos
Hidroxiapatita Ácidos nucleicos
CROMATOGRAFÍA DE REPARTO O DE
PARTICIÓN

La separación
sedápor la partición
del solutoentre dos
fases líquidas
(solubilidadrelativa)
 CROMATOGRAFÍA DE REPARTO O DE
PARTICIÓN
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

Fase estacionaria: papel

Identificación de sustancias:
Relación de frente ( Rf)

Rf distancia recorrida por la sustancia

distancia recorrida por elbidimensional
solvente

=Rf = sustancia

ascendente

descendente
 CROMATOGRAFÍA DE REPARTO O DE
PARTICIÓN
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

• Fase estacionaria: lamina de 0,25 a 0.5 mm sobre

una placa de vidrio o plástico
• Gel de sílice
• Oxido de aluminio
• Silicato de magnesio
• Celulosa
• Poliamida
• Polietileno en polvo
 Mayor poder de
Utilidad: resolución
 Identificar sustancias  Mayor velocidad
de bajo peso de separación
molecular (aa,  Fácil aislamiento de
azucares, péptidos, la sustancia
nucleótidos, lípidos)
CROMATOGRAFÍA DE REPARTO O DE
PARTICIÓN
CROMATOGRAFÍA DE GASES

• Fase estacionaria: liquida

• Fase móvil: gaseosa (helio, argón, nitrógeno)
• Las sustancias a analizar deben volatizarse.

Utilidad:
 Identifica alcoholes,
esteres, ac. Grasos,
aminas.
-12
 Muy sensible (10
gramos
 Muy rápida
 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO
IÓNICO
 fase sólida: contiene grupos
sulfónicos o carboxílicos (para
la separación de cationes) o
grupos amino cuaternarios,
ternarios o secundarios (para
la separación de aniones)
 fase móvil: los iones La fase estacionaria
tiene una superficie
cargada iónicamente,
con cargas iónicas
opuestas a las de
loseluentes
 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO
IÓNICO
• Elección del intercambiador iónico:
• Aniónico o catiónico.
• Elección de la porosidad y tamaño de la matriz:
• Las moléculas pequeñas se separan mejor con tamaño de poro
pequeño.
• Las macromoléculas necesitan tamaño de poro mayor.
• Elección del pH, tampón y condiciones iónicas:
• Tampón catiónico para intercambiador aniónico
• Tampón aniónico para intercambiadorIntercambiadores
catiónico
iónicos:
Dextrano, celulosa,
estireno-divinil-
benceno, acrílica,
fenólica, epoxi amínica
CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN
GEL

Geles:
 Sophadex: polímero de
dextrano
 Agaraso: polímero
La separación se basa
en el tamaño lineal de galactosa
molecular. La fase  Poliacrilamida
estacionaria es un
material de tamaño de
poro definido

Utilidad:
Separación de
moléculas que se
diferencian en su
PESO MOLECULAR.
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

Condiciones:
 La matriz no debe adsorber por si
misma moléculas.
 El ligando debe unirse a la matriz sin
alteración de sus propiedades .
 Debe escogerse un ligando cuya
unión sea fuerte.
 Debe ser posible la elución sin
destrucción de la muestra.
 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

• Utilidad: Purificación de
enzimas

Purificación de anticuerpos
Purificación de
proteínas de
transporte
Purificación de
membranas
Purificación de
glicoproteínas

Separación de células
animales específicas
RADIOISÓTOPOS
 RADIOISÓTOPOS

Descubrió accidentalmente
la existencia de unos rayos
Becquerel desconocidos que provenían
de una sal de uranio

Identificaron que el Polonio

y Radio también emitían Pierre y
radiación espontanea. Madame
Acuñan termino:
RADIOACTIVIDAD
Curie

Irene
Curie Descubrieron la
yFredericJ radioactividad ARTIFICIAL
oliot
RADIOISÓTOPOS
 RADIOISÓTOPOS

• Emiten tres tipos de radiación:

Radiación Alfa Radiación Beta Radiación Gamma

• Carga + • Electrones con carga - • Es de naturaleza
• 2 protones y 2 neutrones (negatrones) o con electromagnética
• velocidad: 10 -9 cm carga + (positrones • Disminuye su energía
/seg • Un neutrón se por emisión de fotones
• Escasa penetración transforma en un protón • Mayor penetración
, electrón y un neutrino • Menor ionización
• Mayor ionización
 DESINTEGRACIÓN RADIOACTIVA

• Incluye la emisión de una partícula beta o alfa del

núcleo del átomo que se desintegra
• La desintegración es proporcional al n° de átomos
radioactivos presentes (cinética de primer orden)
Ley de desintegración radioactiva:
N= No. e -kt
2.3 Log No/N = kt
No: n° de átomos radioactivos en tiempo cero
N: n° de átomos radioactivos que quedan en el tiempo t
LaK:unidad
constante de decaimiento
básica de que es propia de cada
desintegración radioactiva elemento.
es el Curie (Ci)
1 Ci = 3.7 x 1010
12
dps
1 Ci = 2.22 x 10 dpm
 RADIOISÓTOPOS

Utilidad: TRAZADORES:
Para marcar compuestos químicos e introducirlos en
organismos vivos y determinar sus transformaciones
químicas, para dilucidar vías metabólicas

AUTORRADIOGRAFÍA:
Se marca unabiomoléculacon un precursor
isotópico y luego se detecta la imagen por
emulsión fotográfica

RADIOINMUNOENSAYO O
RADIOINMUNOANALISIS:
Cuantificación de sustancias en muy bajas
concentraciones mediante la unión de
sustancias radioactivas a anticuerpos