Validasi dan

Verifikasi Metode
Analisis
Alfas – Surabaya, 29 Maret 2014

Mochammad Yuwono
Fakultas Farmasi Universitas Airlangga
E-mail: yuwono05@yahoo.com

Sharing Knowledge
Ikatan Alumni Universitas Airlangga – Fakultas Farmasi
1
Quality is important in every product
or service, but it is vital in
medicines as it involves life.

2 Sharing Knowledge
Quality
Invisible when GOOD
Impossible to ignore when BAD

How good something is

If the quality of a product is low, it means that
the product is not really good

Sharing Knowledge
Quality of Products

The ability to make the same product

the same way, over and over again.

Customer buys today is same as what

they bought last month or will buy next
month.

Product meets customer’s

expectation.
Sharing Knowledge
4
Quality of Pharmaceutical Products

Man Machine Methods

qualified calibrated characterised

robust documented
skilled qualified suitable
Quality of the
Reference pharmaceutical
Vibrations Time
standards Irradi- Analysts´ products
ations support
Tempe-
Quality rature Humidity Supplies

Material Milieu Management

5 Sharing Knowledge
 Quality in Analytical Laboratory

Analis Akomodasi & Lingkungan

Pendidikan Baku Pembanding,
Reagensia
Pelatihan
Pengalaman

Hasil
Valid &
Preparasi sampel Terpercaya
Verifikasi Kinerja
Presisi

Validitas Kualifikasi

Linieritas
Linieritas Akurasi, LOD,
LOQ Alat/Instrumen Sensitvitas
Selektivitas SST Kalibrasi
Metode Analisis
6 Sharing Knowledge
Quality of Analytical Data

Hirarki Komponen Mutu

Data Analisis
Internal QA
(Sampel kontrol masuk rentang)

Sistem
(memenuhi uji SST)

Metode Analisis
(telah divalidasi/diverifikasi)

Instrumen Analisis
(memenuhi kualifikasi DQ,
IQ, OQ, PQ)

7 Sharing Knowledge
 VALID &
TERPERCAYA
Safety
Pengelola &
Analis
Sampel Dokumen
sistem Mutu Metode
Analisis
Sarana & Bahan Alat/
Prasarana Kimia & SRM Instrumen

Sistem Manajemen Mutu 8 Sharing Knowledge

 Prosedur Analisis

Quality Assurance:
ISO 17025/GLP

Sampel Obat, Obat

Preparasi Sampel – Laporan Hasil
Tradisional, Makanan,
Kosmetik Analisis data

Sampling
9 Sharing Knowledge
Metode Analisis Kimia
Metode Analisis Klasik
• Spot test
• Volumetri/Titrasi (menggunakan indikator)

Metode Instrumental
Spektrometri (UV-Vis, IR, AAS, ICP)
Elektrokimia (Potentiometri, ISE dll)
MS, NMR
Hyphenated Instruments
GC-MS GC-FTIR/MS
Metode Pemisahan LC-MS/MS LC-NMR
Kromatografi (HPLC,
GC, TLC, CE dll)

10 Sharing Knowledge
 Metode Analisis

Pengembangan Optimasi Pre-validasi

Revalidasi Validasi

Implementasi
(rutin)

11 Sharing Knowledge
Metode Standar/Baku

Interlaboratory
In House Validation
Validation of Standard Method
Method (Collaborative
Study)

Verification of
Method

12 Sharing Knowledge
Compendial Methods

Metode yang tertera dalam Farmakope

Merupakan metode Standar yang telah
divalidasi (Full Validation)
Termasuk metode Resmi (Official
method) untuk negara-negara tertentu

13 Sharing Knowledge
Kategori Metode Analisis

Penetapan kadar komponen utama

dalam bahan baku obat atau bahan
aktif dalam sediaan farmasi

Penetapan cemaran atau hasil

Degradasi
Penetapan kuantitatif (II a)
dan uji batas/kualitatif (II b)

Penetapan karakteristik sediaan

(disolusi, pelepasan obat, dll)

Metode analisis untuk identifikasi

14 Sharing Knowledge
Karakteristik kinerja metode USP dan ICH

Presisi
Akurasi
Batas Deteksi (DL/LOD)
Validasi
Batas Kuantitasi (QL/LOQ)
Metode
Selektivitas/Spesifisitas
Linieritas
Rentang
Robustness/Ruggedness
System Suitability Test
15
Sharing Knowledge
Parameter Validasi Menurut USP dan ICH

USP ICH
1. Presisi 1. Presisi
2. Akurasi 2. Akurasi
3. Batas deteksi 3. Batas deteksi
4. Batas kuantitasi 4. Batas kuantitasi
5. Spesifisitas 5. Spesifisitas
6. Linieritas 6. Linieritas
7. Rentang 7. Rentang
8. Robustness
9. Kesesuaian sistem
16 Sharing Knowledge
Akurasi dan Presisi Metode

Akurasi rendah Akurasi tinggi Akurasi tinggi Akurasi rendah

Presisi tinggi Presisi tinggi Presisi rendah Presisi rendah
(Hasil dirata-rata)

17
Sharing Knowledge
 Tahapan Validasi Metode
Literature search
Pengembangan/
Telaah karakteristik Analit
optimasi Metode
Penyiapan bahan dan alat

Permintaan Pembuatan
Validasi protokol Validasi

Penyerahan
Percobaan
dokumen
laboratorium sesuai
protokol validasi

Penyusunan Laporan
Analisis Data
Validasi

18 Sharing Knowledge
19 Sharing Knowledge
 •Suatu proses (percobaan
laboratorium)
•Untuk membuktikan bahwa
karakteristik kinerja metode
Validasi analisis telah memenuhi
persyaratan yang telah ditetapkan
sebelumnya

•Suatu proses (percobaan

laboratorium)
•Untuk membuktikan bahwa
laboratorium mampu
menggunakan metode analisis
baku/standar pada kondisi nyata di
laboratoriumnya

20 Sharing Knowledge
 Verifikasi

 Metode tidak baku

 Metode pengembangan
 Metode baku yang
dimodifikasi Validasi
 Metode baku yang
digunakan di luar
lingkup
21 Sharing Knowledge
Modifikasi metode kompendial

Jika pada verifikasi metode, kondisi pada

Metode kompendial TIDAK diperoleh hasil
yang optimal (misal peak tailing, fronting,
splitting, resolusi pemisahan tidak terpenuhi)
 Laboratorium dapat melakukan modifikasi
atau adjustment.

Pada USP tertera batas-batas modifikasi atau

adjustment yang diperkenankan

22 Sharing Knowledge
Modifikasi/Adjustment metode kompendial

23 Sharing Knowledge
Panduan validasi metode analisis

ICH Q2A : Text on validation of analytical Procedure

ICH Q2B Validation of analytical procedures methodology
FDA-CDER (Center for Drug Evaluation and Research)
a. Reviewer guidance validation of chromatographic methods
b. Submitting sample and analytical data for method
validation
c. Analytical procedure and method validation for human
studies
d. Bioanalytical method validation for human studies

USP: Validation of compendial procedures

USP: Verification of compendial procedures
24 Sharing Knowledge
25 Sharing Knowledge
26 Sharing Knowledge
27 Sharing Knowledge
 Verifikasi Metode

 Adopsi metode baku/standar

 Untuk membuktikan bahwa suatu laboratorium
mampu melakukan analisis di laboratoriumnya
 untuk menunjukkan bahwa kinerja metode dapat
ditiru atau diulang oleh laboratorium yang
bersangkutan dengan hasil yang sama

28 Sharing Knowledge
 Verifikasi

 Metode tidak baku

 Metode pengembangan
 Metode baku yang
dimodifikasi Validasi
 Metode baku yang
digunakan di luar
lingkup
29 Sharing Knowledge
30 Sharing Knowledge
31 Sharing Knowledge
Metode “General Test” (LOD, sisa pijar,
bilangan asam, pH) tidak perlu
diverifikasi

32 Sharing Knowledge
Acuan Verifikasi Metode

33 Sharing Knowledge
 Kategori Analisis

1. Confirmation of Identity,
a method that ensures a material is what it purports to be or confirms the
detection of the target analyte.
2. Quantifying an analyte at a low concentration.
3. Determining if an analyte is present above or below a
specified, low concentration (often called a Limit Test). The specified
concentration is close to the LOQ.
4. Quantifying an analyte at a high concentration.
5. Determining if an analyte is present above or below a
specified, high concentration (often called a Limit Test).
The specified concentration is substantially above the LOQ.
6. Qualitative test.

34 Sharing Knowledge
Parameter Validasi

35 Sharing Knowledge
Parameter Verifikasi

36 Sharing Knowledge
37 Sharing Knowledge
38 Sharing Knowledge
39 Sharing Knowledge
40 Sharing Knowledge
Parameter Verifikasi Metode

Penetapan kadar bahan

aktif dalam sediaan
farmasi

Selektivitas/spesifisitas,
Presisi dan akurasi
merupakan parameter
penting

41 Sharing Knowledge
Selektivitas vs. Spesifisitas

USP dan ICH  menggunakan istilah Specificity

IUPAC dan AOAC  menggunakan istilah

Selectivity

AOAC: Specificity  “highest selectivity”

42
Sharing Knowledge
Specificity (ICH/USP)
Specificity (USP/ICH):
The ability to assess unequivocally the analyte in
the presence of components to expected to be
present, such as impurities, degradation
products, and matrix components.

Selectivity describes the ability of an analytical

method to differentiate various substances in a
sample.
43
Sharing Knowledge
 Spesifik dan Selektif
Selektif:
Mampu membedakan antara senyawa analit dengan
derivat/degradan/ metabolit atau senyawa pengganggu
lainnya

Spesifik:
Mampu mengenal respons untuk analit
tunggal/murni

44
Sharing Knowledge
Spesifisitas/Selektivitas:
Jika tersedia zat hasil degradasi:

Suntikkan:
Blanko sampel/Placebo (Sampel minus
analit)
Zat Hasil degradasi (degradants)
Zat yang memiliki struktur mirip (Related
substances
Zat metabolit (untuk bioanalisis)
45
Sharing Knowledge
 Spesifisitas/Selektivitas:
Blanko sampel/Placebo
 tidak menghasilkan
peak/noda dengan
waktu retensi/Rf yang
sama dengan analit

Peak/noda analit
terpisah dari
peak/noda lainnya
(Rs ≥1,5)

46
Sharing Knowledge
Placebo

Sampel

(Rs ≥1,5)

47 Sharing Knowledge
Meloxicam dalam tablet (spektrofotometri UV/Vis)

48 Sharing Knowledge
 Specificity/Selectivity:

Jika tidak tersedia zat hasil degradasi (Degradants)

 Lakukan forced degradation studies (studi

degradasi paksa)

 Sampel disimpan pada suhu/kelembaban

tertentu atau penambahan oksidator

 Bandingkan profil pemisahan peak sebelum

dan sesudah perlakuan
49
Sharing Knowledge
Forced Degradation Studies

 Heat  Temperature (50 - 60 oC)

 Humidity  Kelembaban (70 to 80%)
 Acid Hydrolysis  HCl 0.1 N
 Base Hydrolysis  NaOH 0.1 N
 Oxidation  H2O2 (3 to 30%)
 Light  UV/Vis

50
Sharing Knowledge
 Spesifisitas: Uji kemurnian analit

 Menggunakan Detektor Diode array

 Teknik Spiking
 Peak hasil spiking  menunjukkan satu
peak/noda dan memiliki tR/Rf sama
 Pada TLC
 menggunakan sistem pengembang berbeda-beda
 GC-MS
 LC-MS; LC-MS/MS

51 Sharing Knowledge
Contoh studi degradasi paksa (HPLC-
DAD)

PENETAPAN KADAR
PAROXETINE
DALAM SEDIAAN
TABLET

52 Sharing Knowledge
Overlay spectra UV - analit

53 Sharing Knowledge
Hasil Degradasi terhadap tablet paroxetine
20 mg
* RRT, relative retention time.

Condition Time % Recovery RRT* of degradation

(h) products
Acid 0.1 N HC1, 80°C 50 98.0 None detected
Base 0.1 , 80°C 50 96.5 1.65
Hydrogen peroxide 0.3%, 80°C 2 73.0 0.19, 0.22, 0.23, 0.27
0.31, 0.35, 0.39, 0.43
0.45, 0.49, 0.52, 0.55
0.59, 0.63, 0.71, 0.76
1.13, 1.36, 1.64
Heat dry, 80°C 72 99.2 None detected
Heat wet, 80°C 72 96.2 1.65
Light dry, 1000 foot candles 144 99.5 None detected
Light wet, 1000 foot candles 144 80.3 0.17, 0.20, 0.23, 0.42
0.44, 0.55, 0.82, 0.88
1.13, 1.60

54 Sharing Knowledge
 Linieritas (Linearity)

Kemampuan suatu metode

untuk menunjukkan hubungan
secara langsung atau
proporsional antara respons
detektor dengan perubahan ●

Respon alat
●
konsentrasi analit.
●
●

A B C D

55
Sharing Knowledge
Linieritas

Melalui analisis statistik

Linear Regression (y = mx + b)
 Correlation Coefficient (r),
 y-intercept (b), slope (m), r
 ( xi  x )( yi  y )
{( xi  x ) 2 ( y  y ) 2 }1/ 2
 residual sum of squares 1

Disarankan menggunakan minimum 5

macam konsentrasi analit
 Disarankan terhadap sampel yang independen, bukan
dari sampel hasil pengenceran
 Dapat digunakan larutan baku hasil pengenceran
dan/atau larutan spike
56 Sharing Knowledge
Evaluasi terhadap Linieritas

Relative process standard deviation (Vxo)

Mandel’ test
Residual test
ANOVA-linearity testing
RSD of the Plot of response factor Vs. concentration
Xp value- Funk’s et al.
 r value
Homogeneity of the linear-curve

57 Sharing Knowledge
Evaluasi Linieritas
S xo
V XO  100%
X

S XO
S
 Y where SY 
 y i
ˆi 
y
ˆ  a  bxi
, y
b N 2

Y  Y 
2
1
X P  2 S XO .ttable .  1  2P with
N b .QXX
1 X2
YP  a  SY . ttable . 1
N QXX

 X 
2
1
QXX   X i  , t  student t factor for f  N - 2
2
i
N
and p  0.05

Sy/x = simpangan baku residu dari regresi linear

Vxo = <2-5%
Vxo = koefisien variansi regresi linear
58 Sharing Knowledge
Koefisien korelasi

 Nilai r ternyata TIDAK menjamin

linieritas respons dan konsentrasi
 Kurva non linier  dapat memiliki r yang
tinggi
 Korelasi linier jika rhitung > rtabel. Harga r
tergantung jumlah konsentrasi. Contoh n = 5 
rtabel = 0,878; n = 10  r tabel = 0,632

 r membuktikan linieritas jika rentang

tidak terlalu lebar dan r ≥ 0,999

59 Sharing Knowledge
 Residual dan Least square

Makin kecil atau makin besar konsentrasi  deviasi makin besar  dikuadratkan dan
diminimasi  Least square

Oleh karena itu, respons harus memiliki varians yang sama (Homogeneity of variance
= homoscedasticity) 60 Sharing Knowledge
Persamaan garis regresi

 koefisien korelasi r ≥ 0,999

 Persamaan garis melewati titik 0,0
 Intersep tidak berbeda secara bermakna
dengan nol  lakukan uji t
 Slope berbeda secara bermakna dengan harga
nol  lakukan uji t

61 Sharing Knowledge
Respons faktor = y/x

62 Sharing Knowledge
Uji Homogenitas

 digunakan untuk mengetahui

homogenitas varian pada persamaan
garis regresi
 Uji F  menguji homogenitas batas atas
dan bawah
 Uji Cochran dan uji Barlett  menguji
keseluruhan titik pada rentang
persamaan garis

63 Sharing Knowledge
64 Sharing Knowledge
Rentang (Range)

Interval antara konsentrasi terbesar

dan terkecil dari analit dalam sampel
Memenuhi syarat dalam hal presisi,
akurasi dan linieritas

65 Sharing Knowledge
Minimum Specified Range:

For Drug Substance & Drug product

Assay
 80 to 120% of test Concentration
For Content Uniformity Assay
 70 to 130% of test Concentration
For Dissolution Test Method
 +/- 20% over entire Specification Range
For Impurity Assays
 From Reporting Level to 120% of Impurity Specification for
Impurity Assays
66 Sharing Knowledge
Uji Homogenitas kurva kalibrasi

67 Sharing Knowledge
Metode Analisis pada Cleaning Validation

Validasi Metode untuk analit konsentrasi

sangat rendah (Residu)
Parameter LOD dan LOQ berperan sangat
penting

68 Sharing Knowledge
Akurasi

Biasanya dinyatakan dalam persen

perolehan kembali (% recovery)
Dapat dilakukan melalui pebandingan
hasil analisis antara metode yang
divalidasi dengan metode standar  uji
t  harus tidak berbeda makna
Dapat dilakukan metode adisi standar
terhadap blanko atau sampel.

69 Sharing Knowledge
Akurasi

 Persen perolehan kembali (% recovery)

Kadar yang diperoleh

% Re c  x100%
Kadar sesungguhnya

Persyaratan untuk assay validation = 98-

102%

 Dianjurkan menggunakan tiga macam

konsentrasi masing-masing 3 kali replikasi
 Adisi standar pada blanko/plasebo

70 Sharing Knowledge
 KURVA AKURASI menurut Funk et. al.

- Untukmengetahui ada atau tidaknya kesalahan sistematis,

Dibuat kurva regresi antara Xf (konsentrasi analit hasil analisis)
terhadap Xc (konsentrasi nominal analit)
Xf = af + bf. Xc
-Dihitung confidence range (Cr) dari intercept {VB(af)} dan slope
{VB(bf)} dari recovery Pada p = 0.05
ttable.Syf
Cr bf = bf 
Qxx
1 Xc 2
Cr af = af  ttable . Syf . 
N Qxx
Syf =
 [Xif - (af + bf - Xi )] 2

N-2

t = Student-t-factor f = N-2, P = 95 %. 71 Sharing Knowledge

M. Yuwono & G. Indrayanto, Validation method of Chromatography Methods of Analysis,
Profiles of Drugs Substances, Excipients and Related Methodology, Vol. 32, Elsevier
Academic Press, San Diego, New York, Boston, London, Sydney, Tokyo, Toronto. In
Press (2005)

72 Sharing Knowledge
Analyte recovery at different concentration

Analyte Ingred. Analyte Mean recovery

Unit
(%) ratio (%)
100 1 100 % 98-102
≥ 10 10-1 10 % 98-102
≥1 10-2 1% 97-103
≥ 0.1 10-3 0.1% 95-105
0.01 10-4 100 ppm 90-107
0.001 10-5 10 ppm 80-110
0.0001 10-6 1 ppm 80-110
0.00001 10-7 100 ppb 80-110
0.000001 10-8 10 ppb 60-115
0.0000001 10-9 1 ppb 40-120
AOAC manual for the Peer-Verified Methods program
73 Sharing Knowledge
Presisi
Kedekatan dari suatu seri pengukuran yang
diperoleh dari sampel yang homogen

Dalam bentuk RSD (relative standard deviation)

Meliputi:
- Repeatability
- Intermediate Precision
- Reproducibility
74

Sharing Knowledge
Repeatability

Kondisi sama pada interval waktu yang

singkat
Satu larutan uji  disuntikkan berkali-
kali pada hari yang sama, alat yang
sama, analisis serta kondisi lain yang
sama.
Disebut juga Intra-assay precision

75 Sharing Knowledge
 Intermediate Precision

Disebut juga “within-laboratory variations”.

Berbeda hari, atau analis, atau instrument (dalam

satu laboratorium)

Sebagai bagian Ruggedness menurut USP

76 Sharing Knowledge
 Reproducibility

Repeatability test at different labs.

Berbeda analis atau instrument dari

laboratorium yang berbeda

77 Sharing Knowledge
 Uji Presisi :

Dianjurkan menggunakan 3 macam

konsentrasi berbeda, misal 80, 100 dan 120
% dari konsentrasi target
Masing-masing konsentrasi dilakukan 3
replikasi
Dapat dilakukan pada satu konsentrasi
dengan 6 kali replikasi
Dianjurkan juga dilakukan pada hari yang
berbeda dan analisis yang berbeda
Kriteria penerimaan: tergantung kategori
analisis atau konsentrasi analit
Contoh: RSD < 2% (kategori I)
78 Sharing Knowledge
Analyte concentration vs precision

Analyte % Analyte ratio Unit RSD (%)

100 1 100 % 1.3
≥ 10 10-1 10 % 2.7
≥1 10-2 1% 2.8
≥ 0.1 10-3 0.1% 3.7
0.01 10-4 100 ppm 5.3
0.001 10-5 10 ppm 7.3
0.0001 10-6 1 ppm 11
0.00001 10-7 100 ppb 15
0.000001 10-8 10 ppb 21
0.0000001 10-9 1 ppb 30
AOAC manual for the Peer-Verified Methods program
79 Sharing Knowledge
Kurva Horwitz

SBR atau KV = + 2(1-0,5 log C)

C adalah konsentrasi (fraksi desimal)

Misalnya : Untuk kadar C = 100%

maka fraksiDapat
desimalnya = 100/100
dilakukan pada satu konsentrasi =1

SBR atau KV = + 2(1-0,5 log 1) = 2%

HORRAT = SBRobs/SBRcalc

80 Sharing Knowledge
81 Sharing Knowledge
Analytical Method for Cleaning Validation

• Metode Analisis hendaknya divalidasi sebelum

validasi pembersihan
• Pemilihan metode analisis untuk analisis
residu berkaitan erat dengan sifat kimia target
residu dan batas deteksinya
• Metode yang digunakan mampu mendeteksi
residu atau kontaminan secara spesifik
 Kromatografi (HPLC, GC, and HPTLC).
 Metode lainnya (sendiri atau kombinasi): TOC, pH,
Konduktivitas, Spektrofotometri UV, ELISA

82 Sharing Knowledge
Analytical Method for Cleaning Validation

 Validasi Metode meliputi :

 Presisi, Linieritas dan Selektivitas (jika target
berupa analit spesifik);
 LOD
 LOQ
 Recovery (melaui spiking analit)
 reproducibility
 Batas Deteksi merupakan paramater sangat
penting.
 LOD di bawah batas konsentrasi residu/
kontaminan yang diperkenankan

83 Sharing Knowledge
Analytical Method for Cleaning Validation

> 80% is considered

good > 50% is considered
reasonable

Recovery < 50% is considered

questionable

84 Sharing Knowledge
 Batas Deteksi

Batas Deteksi:
Konsentrasi terendah analit dalam
sampel yang masih dapat
terdeteksi

85 Sharing Knowledge
Detection Quantitation Limit
Limit (DL) (QL)
Lowest amount of  Lowest amount of
analyte in a sample analyte in a sample
that can be detected that can be quantified
but not necessarily with suitable accuracy
quantitated. and precision.
Estimated by Signal  Estimated by Signal to
to Noise Ratio of 3:1. Noise Ratio of 10:1.

86 Sharing Knowledge
 Detection Limit (DL) and Quantitation Limit (QL)

1. Based in Visual Evaluations

- Used for non-instrumental methods

2. Based on Signal-to Noise-Ratio

- 3:1 for Detection Limit
- 10:1 for Quantitation Limit

3. Based on Standard Deviation of the Response

and the Slope
 menggunakan sampel konsentrasi rendah
 dapat digunakan SD dari residual;
87
SD intrersep
Sharing Knowledge
88 Sharing Knowledge
Based on Signal-to Noise-Ratio

89 Sharing Knowledge
Based on the Standard Deviation of the
Response and the Slope

where
s = the standard deviation of the
response ( SD of blank samples or SD of
intercepts of regression line)
S = the slope of the calibration curve

90 Sharing Knowledge
Robustness
Definition: Capacity to remain unaffected
by small variations in method parameters
Determination: Comparison results under
differing conditions with precision under
normal conditions
 Variations may include: stability of analytical
solution, variation of pH in a mobile phase,
different column (lot/supplier), temperature, flow
rate.

91 Sharing Knowledge
Re-Validation

“When sponsors make changes in the

analytical procedure, drug substance,
drug product, the changes, may
necessitate revalidation of the
analytical procedures.”
“The degree of revalidation depends on
the nature of the change.”

92 Sharing Knowledge
 Terima Kasih

Mochammad Yuwono
Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Surabaya
E-mail: yuwono05@yahoo.com

Sharing Knowledge 93