SECUENCIACIÓN DEL ADN

M.Sc. ELMER RENÉ CHÁVEZ ARAUJO

 Genomas Secuenciados
 En años recientes, se ha logrado la secuenciación a gran
escala del genoma de organismos eucariotes
 Los 5 primeros genomas secuenciados de organismos
pluricelulares son:
 1998 Caenorhabditis elegans - 8 x 107 pb - un nemátodo
 2000 Homo sapiens - 3 x 109 pb - el Humano
 2000 Arabidopsis thaliana - 1.15 x 108 pb- una planta
 2000 Drosophila melanogaster - 1.65 x 108 pb - la mosca
de la fruta
 2002 Anopheles gambiae - 2.78 x 108 pb - el mosquito
vector de la malaria
 Secuenciación de ADN
 Método de Sanger (nobel en 1980)
 Utiliza dideoxinucleotidos (ddNTPs) para
terminar una reacción de síntesis de ADN in-
vitro
 Realizando 4 reacciones
independientes (una para cada
base) se puede inferir la
secuencia original.
 Secuenciación automática
 Sigue el mismo principio
 A diferencia del método anterior cada ddNTP se
marca con una molécula fluorescente diferente
 Esto permite realizar una única reacción en la
cual están presentes los 4 ddNTPs marcados
 Los fragmentos obtenidos se separan por
electroforesis capilar
 La detección se realiza en un punto fijo al final de
la corrida
Secuenciadores automáticos de ADN
ABI Prism 3700
 Secuenciación de genomas
 Cada reacción de secuencia es capaz de
leer unas 500 pb.
 Como se obtuvo la secuencia continua del
conjunto de los cromosomas humanos.
 Cada cromosoma tiene en promedio
150Mb (genoma completo 109).
 Construcción de biblioteca de ADN genómico
fragmentado al azar
 Lectura de secuencias individuales
 Las secuencias individuales son solapadas y
ensambladas (contigs)
 Para asegurarse de que todas las secuencias
estén representadas se leen unas 10 veces la
cantidad de bases del genoma
 La velocidad de producción de las secuencias ha
ido en aumento.
 Recientemente se dió un salto en este sentido
con el desarrollo de los secuenciadores de
“próxima generación”
 No usan terminación de cadena
 Se coloca una base cada vez y se detecta cual fue
incorporada a cada molécula que se esta
secuenciando
 Producen en una única reacción de secuencia
millones de lecturas de fragmentos diferentes
(paralelización)
 108 1010 bases por corrida (menos de 1 día)
 De esta forma se secuenció el genoma entero de
Watson en menos de 1 mes a un “bajo” costo
Sistema Multiplex

* 3 marcadores genéticos
1 amplificación
1 gel

* Resolución: Electroforesis en gel

de poliacrilamida naturante 4%