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t' v'
R R k'
t x x x
i , std t' v' k
R R std
std std
Aplicaciones de la Cromatografía
Información cualitativa
no hay seguridad en la identificación
hay evidencia en la ausencia de ciertos
constituyentes
la información espectroscópica se fortalece si
se realiza una cromatografía previa.
Análisis Cromatográfico
Cuantitativo
uso de planímetros
Columnas
Empacadas
Analíticas
Preparativas
Capilares
WCOT ( Wall Coated Open Tubular)
SCOT (Support Coated Open Tubular)
Alimentación de gases
Componentes necesarios
Controladores de flujo/presión del gas
Dispositivos para purificar el gas (trampas)
3
4 6
2
1
1. Cilindro
2. Regulador de presión primario
3. Trampas para eliminar impurezas
4. Regulador de presión secundario
5.Regulador de flujo (controlador diferencial de flujo)
6. Medidor de flujo (rotámetro)
A = 99,995 % (4.5)
C B = 99,999 % (5.0)
COSTO
B C = 99,9999 % (6.0)
A
PUREZA
Gas portador
Compatible con el detector
Cada detector demanda un determinado gas
de arrastre
DCT He , H2
DIC N2 , H2
t=x
Inyección instantánea
t=0
t=x
Inyección lenta
t=0
t=x
Inyector “en columna” convencional
1
2 1. Septo (silicona)
2. Alimentador de gas
3 de arrastre
3. Block metálico de
4
calentamiento
4. Punta de la
columna
cromatográfica
Inyección “en columna” de líquidos
1 2 3
cuerpo (pyrex)
Microjeringas para inyección
Microjeringa de 1 µL
guia
émbolo (hilo de acero)
Esquema de un puerto de inyección por vaporización
instantánea típico
(a) Válvula rotatoria con seis puertos
(b) válvula de placa deslizante
Métodos de Inyección
•Si se introduce
mucha muestra puede
sobrecargar la línea.
•Puede perderse parte
de la muestra por la
salida de purga.
•Ud debe cuidar que el
volumen de muestra
sea menor que el
volumen de la línea.
Inyección Split
Paso 2: purga on
Modo split
¿Cómo Trabajar?
lenta rápida
Inyección con jeringas
Cuando se usa una jeringa, Ud. ve cuanta
muestra hay en el cuerpo de la jeringa pero no en
la aguja.
Durante la inyección, parte de la muestra puede
volatilizarse en la punta de la aguja, causando
mayor imprecisión.
Esto puede provocar discriminación entre los
componentes de la muestra, esto es peor en las
inyecciones en las columnas capilares.
Métodos de Inyección
Columnas y hornos de columnas
Generalmente son:
Capilares o tubulares
Empacadas o de relleno
Normalmente son:
De 2 a 50 m de longitud
Construidas de acero inoxidable, vidrio, sílice
fundida o teflón
Enrolladas en forma helicoidal con de 10 a 30
cm, según tamaño del horno de columna
Columna Empacada
COLUMNAS CAPILARES
Tipos de columnas
Empacadas Capilares
Columnas Capilares
a) Dimensiones típicas de las columnas capilares o
tubulares abiertas usadas en GC
b) columna cromatográfica de sílice fundida. El del
rollo es de 20 cm y la longitud típica de las columnas es
entre 15 y 100 m
Columnas Capilares
c) Sección transversal de columnas de pared recubierta de
fase estacionaria líquida, sólida y de capa porosa
Fases Estacionarias
Líquidos depositados sobre una superficie de
sólido poroso inerte (columna empacada) o
En tubos finos de material inerte (columnas
capilares)
FE
líquida
SUPORTE Tubo capilar de
Sólido inerte material inerte
poroso
Fases Estacionarias
Para minimizar la pérdida de FE líquida
por volatilización, normalmente el soporte
es:
FE poco Selectiva:
mala resolución aún
con una columna de
buena eficiência
Fases Estacionarias
Características de una FE ideal
Amplio rango de temperaturas de uso
Mayor flexibilidad para optimizar la separación
Buena estabilidad química y térmica
Mayor durabilidad de la columna, no reaccionará
con los componentes de la muestra
////
Fases Estacionarias
Poco viscosa
Columnas más eficientes: menor resistencia a la
transferencia del analito entre las fases
Disponible con elevado grado de pureza
Columnas reproducibles: ausencia de picos
fantasmas en los cromatogramas
Soporte y Fases Estacionarias
Soporte y Fases Estacionarias
Columnas y hornos de columnas
Como la temperatura es una variable importante
en la separación de los diferentes analitos, el
horno de columna debe permitir:
Ajustar la T con una precisión de décimas de grado
Ajustar la T a valores semejantes al punto de
ebullición del analito o ligeramente superiores
Usar rampas de temperaturas cuando hay varios
analitos con distintos p. eb.
Columnas y hornos de columnas
Es recomendable:
Utilizar temperaturas bajas para la elución,
para evitar descomposición del analito
Uso de temperaturas bajas para disminuir
riesgos de alteración de la fase estacionaria
o de la columna
No olvidar que las columnas soportan hasta
ciertas temperaturas, generalmente
alrededor de 300°C.
Polietilenglicol: muy polar, sensibles a la humedad y oxidación
Carbowax, Supelcowax, HP-Wax, etc..
CL - LC
Cromatografía Líquida
La cromatografía líquida clásica se lleva a
cabo en una columna de vidrio, la cual está
rellena de fase estacionaria, luego se
siembra la muestra en la parte superior y se
hace fluir la fase móvil a través de la
columna por efecto de la gravedad.
Cromatografía Líquida
Con el objeto de mejorar la eficiencia en
las separaciones, el tamaño de las
partículas de la fase estacionaria se fue
disminuyendo hasta el tamaño de los
micrones, lo cual generó la necesidad de
utilizar altas presiones para lograr que
fluya la fase móvil, de esta manera nació la
técnica de HPLC.
Tipos de cromatografía líquida
Cromatografía de partición: para especies
poco polares pero no iónicas
Cromatografía de adsorción: se aplica a
especies no polares, isómeros estructurales,
grupos de compuestos
Cromatografía iónica: para especies iónicas
Cromatografía de exclusión: para solutos
de masas moleculares mayores a 10 000
Cromatografía Líquida de Alta
Resolución
HPLC
Cromatografía líquida HPLC
Uno de las técnicas más utilizadas hoy por su:
gran sensibilidad
Capacidad para proporcionar determinaciones
cuantitativas exactas
Permite separar sustancias no volátiles o
termolábiles
Gran aplicación en la industria
Gran campo de aplicación
Cromatografía líquida HPLC
Gran campo de aplicación:
Plaguicidas
Hidrocarburos
Aminoácidos
Proteínas
Ácidos nucleicos
Azúcares
Drogas
Terpenoides
Etc..
Cromatografía líquida HPLC
Eficiencia de la columna en HPLC
Todos los aspectos generales vistos previamente
sobre el ensanchamiento de los pick en la
cromatografía en columnas toman mayor
relevancia en la LC, donde se destacan:
El efecto del tamaño de la partícula de relleno de la
columna
El ensanchamiento extracolumna
Efecto del tamaño de muestra
Cromatografía líquida HPLC
El efecto del tamaño de la partícula de
relleno de la columna
La eficiencia de una columna de HPLC
debería mejorar si disminuye el tamaño de las
partículas de relleno, experimentalmente se
han obtenido reducciones del ancho de banda
de diez y > cuando el tamaño de las partículas
ha disminuido unas 8 veces ( ej: de 45 a 6
µm)
Cromatografía líquida HPLC
El ensanchamiento extracolumna
Corresponde al ensanchamiento de la banda
cromatográfica fuera de la columna durante el
transporte de la muestra:
a través de los tubos de los sistemas de inyección,
A través de los detectores
A través de los conectores del sistema
r u 2
H ex
24 DM
Cromatografía líquida HPLC
El ensanchamiento extracolumna
Ocurre por las distintas velocidades de flujo que
existen en los líquidos si están cerca de las paredes
de los tubos o están en el centro, la porción que se
encuentra al centro del tubo se mueve con más
rapidez que las de la perisferia.
Esto es más notorio cuando se utilizan columnas de
diámetro pequeño.
El control va en la reducción de los tubos del sistema
fuera de la columna
Cromatografía líquida HPLC
Efecto del tamaño de muestra
Se observa una disminución del ancho de
banda al disminuir la cantidad de muestra,
dependiente del mecanismo de separación:
> H : reparto – adsorción
< H : rellenos con fase enlazada en fase reversa o
inversa
Instrumentación para la
Cromatografía Líquida
Una de las necesidades de la
instrumentación en la LC es lograr un
caudal de eluyente que pueda circular por
los rellenos de la columna, normalmente
entre 3 a 10 µm, por lo que se requieren
altas presiones.
Instrumentación para la
Cromatografía Líquida
Componentes:
Recipiente para fase móvil y tratamiento de los
disolventes
Sistema de bombeo
Sistemas de inyección de muestras
Columnas cromatográficas
Detectores
Sistemas de adquisición y tratamiento de datos
Instrumentación para la
Cromatografía Líquida
Esquema probable de un
cromatógrafo isocrático
Recipientes para fase móvil
Material:
vidrio
acero inoxidable
Puede complementarse mediante:
sistemas desgasificadores:
sonificación, burbujear He, vacío, etc..
filtros
Fase móvil
Separación con un solo disolvente de
composición constante:
ELUCIÓN ISOCRÁTICA
Neumáticas
Sistema de inyección de muestras
Sistema de inyección en HPLC
Columnas
Tubos de acero inoxidable de diámetro uniforme,
empacadas que difieren en su relleno y tamaño
Columnas analíticas:
10 – 30 cm, o menores
Se pueden acoplar más columnas
Diámetro interno 4 a 10 mm
Partículas de relleno comunes 3,5, 10 µm
40 000 – 60 000 platos/m, o más
Precolumnas: evita deterioro de la columna
analítica
Hornos de Columnas
Normalmente las columnas trabajan a
temperatura ambiente
Pero es posible mejorar las separaciones
utilizando temperaturas controladas hasta
0,1°, permiten normalmente hasta 150°C
Rellenos de Columnas
Rellenos:
Pelicular
Partículas porosas: micropartículas porosas
de diámetros entre 3 y 10 µm
Rellenos de Columnas
Cromatografía de reparto:
De fase normal: la fase estacionaria de
elevada polaridad
De fase reversa o inversa: la fase estacionaria
no polar generalmente un hidrocarburo y la
fase móvil relativamente polar: ej. Agua,
metanol, acetonitrilo
Detectores
Detector de índice de refracción
Detector de fluorescencia
Detector UV
de longitud de onda fija
de longitud de onda variable
De arreglo de diodos
Detector electroquímico
Amperométrico
conductimétrico
Detector de Arreglo de Diodos DAD
DAD
Imagen 3D
Sistemas de separación
Selección de la columna
Selección de la fase móvil
k’
Derivatización:
Tipos:
Precolumna
Postcolumna
Finalidad:
Para reducir polaridad de las especies
Para aumentar respuesta del detector
Para aumentar selectivamente la respuesta del detector
Problemas comunes en HPLC
presiones altas
baja resolución
cambios en tR
Variaciones línea base
Ruido
Pic falsos
Etc..
Trabajo
Muestras filtradas por ultramicro filtros
Desgasificadas, uso de baños de
ultrasonido.
Uso de reactivos calidad cromatográficos
Es conveniente uso de precolumnas
Como los detectores no son destructivos, es
posible realizar cromatografías preparativas