LIC.

PIO HUAMANI MORAN

 Consiste en observar los microorganismos
vivos que puede haber en el producto
examinado, sin fijación ni tinción, en
suspensión acuosa, pudiendo objetivar su
cantidad, sus características morfológicas y
su movilidad.
 Es una técnica de fácil realización, en la que el producto a
examinar se sitúa entre porta y cubre.
 Si el material procede de una toma en medio sólido o de una
toma directa, se emulsionará en una gota de agua destilada o
solución salina.
 Si el material es líquido se depositará directamente entre
porta y cubre.
 El volumen de la gota debe ser adecuado a las dimensiones del
cubreobjetos ya que, en caso contrario, un exceso de líquido
se traducirá en un desbordamiento de éste bajo los límites del
cubre, o un cubre "flotante" que dificultará nuestra
observación por la formación de corrientes líquidas.
 Si el producto va a permanecer mucho tiempo en el
portaobjetos, es conveniente prevenir la desecación mediante
la aplicación de parafina en los bordes inferiores del
cubreobjetos.
 La observación se realiza, en general, con objetivo de 40x en
microscopio de campo claro.
 La microscopía de contraste de fases y de campo oscuro
facilita mucho la visión en fresco.
 Los exámenes en fresco permiten, además, observar la
presencia de otros elementos formes, como leucocitos,
cristales, etc., que pueden ser de gran ayuda en la valoración
de las muestras.
 La morfología de las bacterias en espiral se
altera mucho cuando se disecan o se tiñen;
deben, por lo tanto, examinarse en estado vivo.
 Cuando las bacterias se observan para
determinar si son o no móvil es obvio que tienen
que estar suspensas en un medio líquido en el
que puedan moverse libremente en el caso de
ser móvil.
 Para observar los cambios citológicos que
ocurren durante la división hay que observar los
microorganismos en estado vivo.
 Por este método se observan fácilmente algunas
inclusiones celulares como vacuolas y materias
grasas.
 TÉCNICA DEL MONTAJE HÚMEDO
 Las preparaciones húmedas se efectúan
colocando una gota del cultivo en medio líquido
sobre una lámina porta objeto y cubriéndolo con
una laminilla, haciendo una ligera presión para
repartir el material en capa fina y uniforme
evitando la formación de burbujas

 Para evitar la evaporación y el efecto de las

corrientes de aire, se sellan los bordes de la
laminilla del preparado con vaselina, cera u otra
sustancia semejante.
 TÉCNICA DE LA GOTA PENDIENTE
 Esta preparación se realiza colocando una gota
de la suspensión bacteriana en un cubreobjetos
en el cual se ha hecho previamente un círculo
con vaselina o parafina . La vaselina actúa como
sellador.
 Sobre el cubreobjetos se coloca un portaobjetos
con una excavación central que queda adherido
gracias a la vaselina
 Se invierte la preparación y se observa
colocándola en la platina del microscopio
 Demostrarlas variadas formas, disposición y
movilidad de algunas bacterias
 Los microorganismos vivos son casi incoloros y no pueden
ser visualizados fácilmente al microscopio óptico normal
cuando se encuentran suspendidos en agua, de ahí que se
utilicen colorantes par incrementar sus contrastes con el
entorno que los rodea y de esta forma hacerlos visibles
 Las coloraciones bacterianas se realizan para estudiar la
morfología, agrupaciones y estructura como cápsula,
esporas , flagelos etc. Que ayudan a identificar de una
especie o grupo en particular.
 Las bacterias tiene afinidad por los colorantes derivados de
la anilina o especialmente de carácter básico
 Para una buena función hay que tener en cuenta la
naturaleza de la bacteria, edad del cultivo, el carácter
acido o básico del medio preferentemente y una buena
técnica de aplicación
 Esaquella sustancia o compuesto orgánico
que tiene los grupos CROMÓFOROS que le
comunican al cuerpo la propiedad de color y
AUXOCROMO que le confiere la propiedad de
asociación electrolítica que le permite fijarse
al objeto
 Por su origen
 Colorantes naturales Son colorantes extraídos de organismos
animales y plantas . Ejm. el carmín, hematoxilina, indigo,
orceina.
 Colorantes artificiales. Son colorantes obtenidos de las
destilación fraccionada de la hulla. Ejm. las anilinas
 Por su afinidad tintórea
 Básicos: Son colorantes nucleares, muestran afinidad por las
porciones ácidas de la célula. Ejm. Cristal violeta o violeta de
genciana, azul de metileno, fucsina básica. Etc.
 Ácidos: Son colorantes citoplasmáticos, presentan fuerte
afinidad por las porciones básicas de la célula. Ejm. Ácido
pícrico, eosina, fucsina básica, safranina.
 Neutros: Asocian un colorante ácido y un básico poseen las
propiedades de ambos, Ejm, eosinato de azul de metileno,
Giemnsa, etc.
 Mordiente:
 Esuna sustancia que con el colorante
reacciona formando compuestos insolubles
incrementando la fijación del colorante a las
bacterias.
Pueden ser: Químicos por ejemplo: fenol,
yodo, sulfato de anilina, ácido tánico, fierro,
cobre etc. Físicos como por ejemplo el calor
 COLORACIÓN SIMPLE se llama así porque
nada mas usan un solo colorante, que
puede ser azul de metileno, cristal violeta,
safranina. Con este tipo de tinción se crear
un contraste con el medio donde estas
haciendo extensión y se puede observar la
morfología y la disposición bacteriana.
COLORACIÓN DIFERENCIAL .Es aquella donde
usas mas de 2 colorantes, uno es colorante de
contraste. Con esta tinción se puede ver
morfología, tamaño, organización de las bacterias
y además categorizar los microorganismos en
varios grupos, según su afinidad con el colorante
que se esta utilizando.
 Hay varios tipos de tinción diferencial pero las
que uno mas usa son:
COLORACION DE GRAM
COLORACION DE ZIEHL NEELSEN O
ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTES.
 COLORACIONES ESPECIALES O ESPECIFICAS
es aquella donde usas mas de uno o dos
colorantes. Con esta coloración se puede ver
morfología, tamaño, organización de las
bacterias y además estructuras especiales
como esporas, pared celular, flagelos,
cápsula de los microorganismos.
 Hay varios tipos de tinción

COLORACIÓN DE SHAEFFER- FULTON (

ESPORAS)
COLORACIÓN VAGO ( ESPIRILOS)
COLORACIÓN DE CÁPSULA
COLORACIÓN DE FLAGELO ETC.
 Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica y
esperar que enfríe un poco.
 Tomar el asa (previamente flameada) y con ésta coger un poco de
muestra.
 Una vez obtenida una pequeña cantidad de la muestra (con el
asa), hacer que ésta tenga contacto con una lámina
portaobjetos, la cual servirá para depositar la muestra contenida
en el asa.
 Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lámina
portaobjetos, proceder a realizar la extensión de la muestra en
el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con
el asa) sobre la lámina, de tal forma que al terminar la
extensión, tengamos como producto una espiral en la parte
media de la lámina. (EXTENSIÖN)
 Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un
mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor
no debe ser directo (sólo se pasa por la llama), puesto que el
calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las
bacterias a observar. El calor deseable es aquél en el que el
portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado
sobre el dorso de la mano. (FIJACIÖN)
 OBJETIVO:
Observar las características morfológicas,
agrupación y tamaño de la bacteria
 DISEÑO EXPERIMENTAL
Materiales:
 Cultivo de 24 horas en medio líquido y medio sólido de
Staphylococcus aureus, Pseudomonas spp, E. coli,
Bacillus subtilis, Streptococcus spp.
 Mechero, asa bacteriológica

 Láminas portaobjeto.

 Colorantes: Azul de metileno. Cristal violeta, safranina

 Microscopio compuesto

 Solución salina estéril, aceite de inmersión

 PROCEDIMIENTO:
 Preparar una extensión a partir de un cultivo
bacteriano de 24 horas y fijelo.
 Cubrir el preparado con gotas del colorante y
deje actuar dependiendo del colorante
durante 30””, 1 a 3 minutos.
 Lavar con agua corriente, secar
 Observar la lamina coloreada con objetivo de
inmersión utilizando una gota de aceite de
inmersión
 Anote sus resultados.
Forma esférica COCO

División a lo largo del mismo plano,

formando cadenas cortas
2 cocos juntos: Diplococos
División a lo largo del mismo plano,
formando cadenas 4 - 20 en cadenas:
Estreptococos

División a lo largo de 2 planos diferentes:

Tétradas

División a lo largo
de 3 planos regularmente:
Sarcinas

División a lo largo
de 3 planos irregularmente: Estafilococos
Forma de vara BACILO

Dos bacilos juntos: Diplobacilos

Cadenas de bacilos: Estreptobacilos

Empalizadas, Bacilos lado con lado o en

figuras en X, V o Y
 Forma de coma VIBRIO

Forma espiral rígida se llama: Espirilo

Si la espiral es flexible y ondulada se

llama: Espiroqueta
 COLORACIÓN SIMPLE

Toma de Extensión
muestra y fijación

COLORACIÓN ( un solo colorante)

Cristal violeta 30” Safranina 1’ Azul de metileno 1’

Observar con
Lavar y
Objetivo de
secar
inmersión
Colorante Safranina
Colorante safranina Colorante cristal violeta
Colorante Safranina Colorante azul de metileno
Colorante cristal violeta Colorante azul de metileno
Colorante Safranina