BIOMOLÉCULAS

Fredy Quispe Jacobo

 Cromatografía de afinidad
Se origina en las reacciones específicas, por ejemplo de enzima – sustrato, o de
otro tipo: Antigeno – Anticuerpo, Histidina- Ni/Co GST - Glutation

http://www.gelifesciences.com/file_source/GELS/Service%20and%20Support/Documents%20a
nd%20Downloads/Handbooks/Affinity_chromatography_handbook.pdf
 CROMATOGRAFIA DE INTERACCIÓN
HIDROFÓBICA
HIC, separa proteínas de acuerdo a las diferencias
en su superficie hidrofóbica utilizando interacciones
reversibles de las proteínas y la superficie hidrofóbica
de un medio HIC. No hay una teoría universal aceptada
que muestre el mecanismo HIC. Sin embargo esta es
afectada por el medio (sales).

Una alta concentración de sales favorece la interacción

de zonas hidrofóbicas , mientras que una baja
concentración disminuye la interacción.
P-hidrof/hidrof aa

La sal disminuye la ..

> hydrofobico

Gradiente decreciente

Modificadores/detergentes
• La fuerza de elución y precipitación de un ión
se describe por la serie de Hofmeister. Es la
habilidad de un ion para PRECIPITAR o
producir caos en una estructura acuosa
SERIE DE SALES DE HOFMEISTER
 Teoría termodinámica - HIC
Se describe por la ecuación: ΔG= ΔH-TΔS
Fuerzas de van der Waals – tension superficial
 CONDICIONES en una HIC
• H2O
Predominio de fuerzas de cohesión con altos pe y tensión
superficial. Una biomolécula en agua presenta interacciones
hidrofilicas e hidrofóbicas, si es de naturaleza hidrofóbica
ocupa mínimas volúmenes y áreas superficiales.
• Estructura de la biomolécula,
la interacción entre los monómero de la molécula da lugar
lugar a interacciones intramoléculares dando como
consecuencia una determinada conformación
tridimensional. Ejem: proteínas globulares como como
queratina, miosina; fibrosas como albuminas, globulinas,
 Interacciones: reversibles
• Los ligandos hidrofóbicos en un HIC pueden
interactuar con las superficies de la proteínas.
En agua las interacciones son débiles entre el
ligando y la biomolécula, sin embargo en
presencia de sales, la interacción se
intensifica. Esto dependerá de la fuerza iónica
del medio.
 Pasos en una separación: HIC
• Los ligandos utilizados en una HIC contienen
grupos alquilo o arilo sobre una matriz esférica y
porosa
• La columna es equilibrada con buffers que llenan
los poros y el espacio en la matriz
• La interacción es favorecida con sulfato de
amonio 1-2 M o cloruro de sodio 3M. Estos son
seleccionados de acuerdo a la proteína
• Cuando la muestra es eluida sobre una HIC la
columna se lava y la señal del detector UV
regresa a la línea base. En algunas ocasiones se
necesitaría NaOH, EtOH o Isopropanol para una
limpieza total de la columna.
Ligandos
• La figura muestra diferentes grados de superficie
hidrofóbica y sus separaciones correspondientes
 Condiciones de separación

En la cromatografía, las superficies hidrofóbicas de

la columna interactuan con las zonas hidrofóbicas
de las biomoléculas que se favorecen por la fase
móvil.
 Determinación de parámetros
cromatográficos
• Resolución: combinación del grado de separación
entre los picos eluidos de la columna (selectividad)
y la habilidad de la columna para producir picos
estrechos, simétricos (eficiencia). Estos factores
son influenciados por las propiedades de la matriz
(FE), ligando, condiciones de elución, empaque de
la columna y flujo.
• Rs, como se mide en las mismas unidades, es
adimensional, DANDO una MEDIDA de la
separación RELATIVA entre los 2 PICOS y puede ser
usado despues para la OPTIMIZACIÓN DE LA
SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA
Selectivity

• Es el grado de separación entre los picos es mas

importante que la alta eficiencia
 USOS

Bioprocesos

https://www.you
tube.com/watch
?v=N7vxq948l-U
 ELECTROFORESIS
Cátodo
La electroforesis es un método Matriz
-
de SEPARACIÓN en el que se
utiliza un campo eléctrico
controlado con la finalidad de + -
separar biomoléculas según su
tamaño y carga eléctrica a
través de una matriz. +
Ánodo
Como las moléculas cargadas pueden ser de distinto tamaño, se
moverán a diferentes velocidades
 TIPOS DE ELECTROFORESIS
• Electroforesis convencional.
• Electroforesis capilar.

• ELECTROFORESIS CONVENCIONAL: Se lleva a cabo

sobre una capa delgada y plana o placa de un gel
semisólido y poroso que contiene un amortiguador
acuoso. Igual que en CCF, se pueden efectuar múltiples
separaciones. Las muestras se disponen como manchas
o bandas sobre la placa y se aplica un potencial de
corriente continua durante un periodo de
tiempo fijo. Las especies separadas se tiñen para
visualizarse. Los volúmenes separados son del orden
de los μL.
El movimiento de las moléculas en solución acuosa será
afectada por el proceso de hidratación

Iones pequeños como Na+ y Macromolécula con

Moléculas
Cl - asociados a moléculas grupos polares cargados
de agua
de agua asociados a moléculas de
agua
 Electroforesis

(+) (–)
ánodo cátodo
Carga eléctrica de la biomoléculas

1. Proteínas
2. Ácidos nucleicos
Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un
campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee
carga opuesta y emigran según su carga.

Pero también hay dos fuerzas adicionales:

1. La fricción que junto al solvente dificultará el movimiento de las moléculas
cargadas en forma opuesta.
2. El movimiento aleatorio o movimiento browniano permitirá una difusión que
dependerá de la temperatura, a mayor temperatura mayor difusión.
La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una
manera homogénea, de tal manera que, si las moléculas son colocadas en un
cierto lugar de solución, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya
anchura aumentara con el tiempo.
 ELECTROFORESIS

Cátodo
q (carga)
- Velocidad = E
f (tamaño, forma)

+ - 1. Muestra
2. Tampón: mantenimiento de pH y conductividad

+ 3. Soporte
Ánodo 4. Equipo electroforético:
• Fuente de alimentación
• Cubeta de electoforesis
EQUIPOS ELECTROFORÉTICOS
 TIPOS DE ELECTROFORESIS

Cátodo
1. Electroforesis libre (Arne Tiselius, 1937)
- En solución. Difusión, convección.
2. Electroforesis de zona

+ - • Soportes no restrictivos
• Papel, acetato de celulosa
• Agar, agarosa
+ • Soportes restrictivos
Ánodo • Almidón
• Poliacrilamida
 Electroforesis libre
En la electroforesis libre
una disolución tamponada
de la mezcla de proteínas
se coloca en una célula de
observación en forma de U
mayúscula, depositando
una capa de tampón
(buffer) puro sobre la
disolución de proteínas.
 ELECTROFORESIS DE ZONA

La muestra esta obligada a desplazarse sobre un

soporte solido tal como el papel, acetato o ciertos geles.
MECANISMOS DE
SOPORTE
El entramado no interfiere en la migración, ya que el tamaño de las moléculas es muy
pequeño en comparación con el tamaño de poro del soporte .

ACETATO
PAPEL CELULOSA
AGAROSA

• Separación • Se usa en • Es un
de sustancia análisis polisacárido
de bajo peso biológicos • Se usa para
molecular • Débil la
resolución separación
de ácidos
nucleicos
El tamaño de poro pone restricción al paso de las moléculas.

GELES DE
POLIACRILAMIDA
ALMIDÓN
• Proviene de • El mas usado en
diversas la electroforesis
fuentes • Son geles
naturales completamente
inertes,
estables y
transparentes
 Papel
• Fue el primer soporte usado en las técnicas de
electroforesis desarrolladas para separar
compuestos (Tiselius, 1937).
• Es fácil de usar porque no se requiere preparación
de la matriz.
• Es limitada su capacidad resolutiva.
• Sirve para el análisis y resolución de pequeñas
moléculas. No se usa para resolver
macromoléculas debido a la adsorción y tensión
asociada a la superficie que denatura o altera a la
macromolécula.
ELECTROFORESIS
CON PAPEL
 Acetato de celulosa
• En 1957, Kohn usó acetato de celulosa como medio de
soporte.
• Es un método muy usado para separa proteínas de suero

Kohn, J., A cellulose acetate supporting medium for zone electrophoresis, Clin. Chim. Acta, 2, 297, 1957.
SEPARACIÓN EN ACETATO DE CELULOSA DE PROTEÍNAS DE
SUERO EQUINO

Materiales

Cuba electroforética
Fuente de poder de 200 v
Tira de acetato de celulosa gelificado (Cellogel)
Buffer barbital (veronal veronal sódico)
Colorante Amido Schwartz
Solución decolorante
Metanol 237 mL
Agua 237 mL
Ácido acético 25 mL
 Almidón
• Smithies usó un gel de almidón como medio para electroforesis
en 1955.
• Muy usado para evaluar isoenzimas
• Ventajoso porque es simple de preparar, no es toxico, equipos
usados es relativamente barato, las muestras no requieren ser
separadas, sino crudas
• El gel de almidón puede ser cortado horizontalmente
permitiendo ensayo de múltiples enzimas

Smithies, O., Zone electrophoresis in starch gels: group variations in the serum proteins of normal
human adults, Biochem. J., 61, 629, 1955.
Fosfogluconato deshidrogenasa en gel de almidón de variedades de arroz y
poblaciones de arroz rojo colectadas en las zonas arroceras de Venezuela
 AGAROSA
• Es un método normalizado que se utiliza para separar,
identificar y purificar fragmentos de ADN o ARN.
• La agarosa, coloide natural que se extrae de las algas,
es un polisacárido lineal (con un peso molecular
medio de ~12 000 Da) formado por la repetición de la
unidad básica, la agarobiosa, que comprende
unidades alternadas de galactosa y 3,6-
anhidrogalactosa
• Los geles de agarosa poseen grandes «poros» y se emplean
fundamentalmente para separar las moléculas grandes con
un peso molecular de más de 200 kDa.
• Buffer de corrida: Se dispone de varios tipos de tampones
para la electroforesis de ADN nativo bicatenario.
Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE), tris-borato
(TBE) o trisfosfato (TPE) a una concentración de
aproximadamente 50 mM (pH 7,5 – 7,8).
Gel de Agarosa – Acidos Nucleicos
• Separación por TAMAÑO
• Densidad de carga igual para todas las moléculas por los
grupos PO4-
 Geles de Agarosa
Aplicaciones:

 Separar, identificar y purificar fragmentos de DNA o

RNA.
 Determinar tamaño de un fragmento de DNA.
 Análisis de productos de PCR, p.e. en diagnóstico de
genética molecular, análisis fingerprinting.

Tinción
• Ejemplo Bromuro de etidio
• Autoradiografia 32P,
• Blotting (ver luego)
 Poliacrilamida
• En 1959 Ornstein/Davis y Raymond y Weintraub utilizaron geles
de poliacrilamida.
• Los geles de poliacrilamida se forman por polimerización de la
acrilamida por acción de un agente entrecuzador (TEMED),
• Es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser
preparado de forma rápida y reproducible.
• Forma geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en
agua, relativamente no iónicos y que permiten buena visualización
de las bandas durante un tiempo prolongado.
• Otra ventaja de que variando la concentración de polímeros, se
puede modificar de manera controlada en el tamaño del poro,
lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido
a su neurotoxocidad.
Ornstein, L. and Davis, B. J., Disc Electrophoresis, Distillation Products Industries (Division of Eastman Kodak Co.),
1959.
Raymond, S. and Weintraub, L., Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis, Science, 130, 711,
1959.
Un gel es un estado intermedio entre un sólido y
un líquido, se encuentra entre los métodos más
resolutivos para separación de biomoléculas. Los
geles de uso más generalizado son la
poliacrilamida y agarosa. Estos poseen POROS
diferentes dimensiones moleculares que
DELIMITAN el traslado de moléculas durante el
proceso electroforético.
De esta manera la separación no se produce SOLO
por DIFERENTES CARGAS sin también por
DIFERENCIAS de TAMAÑO. Los geles formados son
una red tridimensional de enlaces formados por
donde el líquido intersticial se encuentra en la red.
POLIACRILAMIDA
• Son estables en un amplio intervalo de
valores de pH, temperatura y fuerza iónica
• Son resistentes a los
agentes
desnaturalizantes
Estructura de la poliacrilamida
Electroforesis en geles de
acrilamida Proteínas
presentes en el
extracto celular

Enzima RNA
polimerasa de la
Lehninger Principios de Bioquímica 4ta Edición bacteria E coli
Electroforesis en geles de acrilamida
SDS (SDS-PAGE)
• Compuesto de gran carga
negativa.

• Utilizado para estimar la

pureza y la masa
molecular.

• Se une a las proteínas en

una cantidad proporcional a
la masa molecular.
Lehninger Principios de Bioquímica 4ta Edición
• Confiere a todas las
proteínas un cociente
Carga/Masa similar.
 SDS - PAGE
• Separa a las proteínas
casi exclusivamente
en función de su masa
molecular

Lehninger Principios de Bioquímica 4ta Edición

 DETERMINACION DEL TAMAÑO DE UNA
PROTEINA PROBLEMA

(RF)

RF = distancia recorrida por la banda

distancia total al frente de la corrida
EJEMPLO DE TINCION CON AZUL
DE COOMASSIE
EJEMPLO DE TINCION CON PLATA

Silver staining is usually

10-100 times more
sensitive than Coomassie
Blue staining, but it is
more complicated.
Faint but still visible bands
on this gel contain less
than 0.5 ng of protein!
 Geles en gradiente
• El uso de geles de poliacrilamida que tienen un
gradiente creciente de concentración de
acrilamida+bisacrilamida, y en consecuencia un
gradiente decreciente en el tamaño de poro, pueden
tener ventajas sobre los geles de concentraciones
uniformes de acrilamida.
 Características de los geles en gradiente.

• Generalmente los gradientes se establecen entre el 3 y el 30%

de acrilamida en gradientes lineales o cóncavos.
• El rango a emplear dependerá del tamaño de las proteínas a
separar.
• En un gel en gradiente la proteína migra hasta que alcanza
una zona donde el tamaño de poro impide cualquier avance.
• Una vez se alcanza el “límite de poro” no se produce una
migración apreciable aunque no se detiene completamente.
 Ventajas

• Resuelve mejor las bandas pues las concentra

en regiones muy estrechas.
• Incrementa el rango de pesos moleculares que
se pueden resolver en un mismo gel
comparado con los de una concentración fija.
 Preparación de gradientes
• Los geles en gradiente se preparan mezclando las
soluciones de acrilamida de las concentraciones
extremas en un formador de gradientes.
• Se suele adoptar la inclusión en la solución de
polimerización de glicerol o sacarosa para aumentar
la densidad de las soluciones y evitar las mezclas en
el proceso de preparación del gradiente.
 ISOELECTROENFOQUE

 Método electroforético que separa proteínas de

acuerdo a su punto isolelectrico (pI)
 Es ideal para la separacion de sustancias anfotéricas
 La separacion se logra aplicando un diferencial de
potencial a traves del gel que contiene un gradiente de
pH.
 El isoelectroenfoque requiere una matriz solida tales
como los geles de agarosa o de poliacrilamida.
IEF
Separates proteins by their
isoelectric points (pI)
Each protein has own pI = pH
at which the protein has equal
amount of positive and
negative charges (the net
charge is zero)
A TYPICAL ISOELECTRIC FOCUSING GEL
 ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

Separación por:
• Punto isoeléctrico
• Tamaño
Separación por Punto
Isoeléctrico
Punto isoelectrico igual Punto isoelectrico diferente
pero diferente tamaño pero del mismo tamaño
 ZIMOGRAFIA
Una técnica electroforética que permite observar actividad de enzimas
 Actividad de proteasas
• La polimerización de la poliacrilamida se realiza en presencia de gelatina
soluble. De esta manera el gel resultante contendrá gelatina (colágeno
desnaturalizado).
• Luego de realizar la corrida electroforética de las muestras el gel se lava en
una solución con Tritón X100 y se incuba en un buffer apropiado que
favorece la actividad de las proteasas. El resultado de este tipo de geles, es
que en la zona donde se ubicó una proteasa la gelatina habrá sido
degradada. Esta degradación se revela tiñendo el gel con colorantes que
tengan afinidad por proteínas, observándose una zona blanca donde hubo
degradación

Actividad de enzimas (genérico)

• Consiste en realizar una electroforesis en condiciones nativas (sin detergentes
ni agentes reductores) o semidesnaturalizantes (sin agentes reductores).
Luego una vez terminada la corrida electroforética se preincuba el gel en un
amortiguador apropiado para la enzima en estudio (sin agentes
desnaturalizantes). luego el gel se incuba en otro amortiguador similar al de
preincubación pero con el sustrato incluido (de preferencia fluorescente). El
gel es revelado bajo una lámpara UV
Zimografía

Actividad proteolitica en geles

SDS-PAGE copolimerizado con
gelatina.

Referencia: Diferenciación de clones de papa resistentes y susceptibles a

mosca minadora (Tesis Maestría 2000. José Olivera)
ELECTROFORESIS CAPILAR
Método instrumental fundamentado en la electroforesis
convencional. Relativamente nueva. Da lugar a separaciones
de volúmenes muy pequeños (de 0,1 a 10 nL), con mucha
rapidez y resolución. Usa los mismos detectores
cuantitativos que la técnica HPLC, en lugar de las tinciones de
la técnica convencional. La velocidad de migración (v), de un
ion en cm/s viene dada por:

donde E es la intensidad del campo eléctrico (V/cm) y μe es la

movilidad electroforética (cm2/V s). E = V/L, donde V es el
potencial aplicado en voltios y L es la longitud sobre la que
se aplica el campo.
• NUMERO DE PLATOS EN ELECTROFORESIS CAPILAR:
Por existir una única fase en la separación, N sólo
depende de la difusión longitudinal, y su expresión
viene dada por:

• donde D es el coeficiente de difusión del soluto en

cm2/s. Se usan potenciales elevados para mejorar la
eficiencia de separación.
 COMPONENTES
- Fuente de potencial constante
- Columnas, capilares de sílice fundida de
diámetros internos entre 1 y 100 um cubiertas
con poliamida para darle flexibilidad y fragilidad
(ayuda a la disipación del calor generado por la
resistencia eléctrica). Transparente a luz UV-Vis
- Recipientes del electrolito
- Sistema de inyección de muestra (hidrodinámica,
electrocinética)
- Sistema de detección, UV-Vis, DAD, Fluorescencia
Electroforesis capilar
Ventajas de la electroforesis capilar

•Alta resolución (105 a 106 platosteóricos)

•Requiere pequeño volumen de muestra (1-10 nl)
•Rápida separación (1 a 45 min.)
•Aplicable a todo tipo de sustancias
•Automatización
•Cuantificación (lineal)
•Reproducibilidad
•Puede acoplarse a espectrometría de masa
Esquema de equipo de CE
Tipos de moléculas que pueden ser
separadas por CE

•Proteínas
•Péptidos
•Amino ácidos
•Ácidos nucleicos
•Iones inorgánicos
•Bases orgánicas
•Ácidos orgánicos
Condiciones de CE

•Se utilizan altos voltajes 10-30kV.(>500V/cm; 10-20

mA)
•Moléculas positivas, negativas o neutras puede
separarse.
•La separación se realiza en un tubo capilar de sílice
fundida cubierta con poliamida para darle
flexibilidad.
•El tubo capilar tiene 30-100 cm. De longitud y 25-
100 de diámetro interno.
•Los grupos hidroxilos de la sílica se disocian
dejando el tubo con una carga negativa.
FLUJO ELECTROOSMÓTICO: Movimiento por el
cual el disolvente tamponado migra hacia el ánodo o
hacia el cátodo. El movimiento es causado por la doble
capa eléctrica que se forma en la interfase
sílice/disolución. A pH mayor a 3, la pared interna de
un capilar de sílice tiene carga negativa por la
ionización de los grupos silanol de la superficie. Los
cationes del buffer se agrupan sobre la superficie
negativa del capilar para formar la doble capa eléctrica.
Los cationes situados en la capa exterior difusa de la
doble capa son atraidos hacia el cátodo negativo y como
están solvatados, arrastran al resto de la disolución con
ellos.
FLUJO ELECTROFORETICO
Bajo la acción de un campo eléctrico los solutos iónicos
se desplazan a través de la columna debido al flujo
electroosmótico que arrastra todo el seno de la solución
y por ende los solutos iónicos, y por otro lado por la
PROPIA CARGA del soluto hace que este muestres una
movilidad por si mismo. Esta es función de la CARGA,
RADIO asumiendo un geometría esférica y la
VISCOSIDAD del medio.
Tubo capilar de sílica con grupos OH expuestos
Flujo electroendosmótico
Migración
Movilidad en CE
 = v/E = Q/ 6r
 Modalidad Criterio de separación Sustancias

EC de zona Densidad de carga Moléculas pequeñas,

(CZE) péptidos, proteínas,
DNA pequeño.

Electroenfoque pl Péptidos, proteínas.

Cromatografía Densidad de carga y Moléculas pequeñas,

micelar coeficiente de reparto péptidos, DNA.
electrocinética en las micelas, según la
capilar (MECC) hidrofobicidad

EC en gel Masa molecular Péptidos, proteínas,

Desnaturalizante Tamaño y densidad de DNA
No desnaturalizante carga.
Surfactantes
en MECC