“Nuevas Tendencias en la construcción

de sensores electroquímicos”
Profa. Dra. Maria del Pilar Taboada Sotomayor
mpilar@iq.unesp.br

UNI, Agosto 2010

 Programa

1. Introducción
2. Breve definición de sensores y biosensores
3. Sistemas biomiméticos enzimáticos:
3.1. Catalizadores biomiméticos
3.2. Consideraciones teóricas
3.3. Sistemas basados en enzimas cúpricas: Tirosinasa
3.4. Sistemas basados en heme-enzimas: Peroxidasa y P450
3.5. Consideraciones finales
Porqué surgieron los sensores e
biosensores?
 Necesidad de un control de calidad cada vez más
rígido:
a) confiables
b) precisos
c) exactos
 Búsqueda por métodos de análisis más:
a) selectivos
b) sensibles
c) rápidos
d) baratos
e) menor cantidad de residuos “ambientalmente
amigables”
 SENSORES

 Como definir un sensor?

Dispositivo usado para medir una cantidad física o

química, transformándola en algún tipo de señal
mensurable que puede ser fácilmente detectada.
 Componentes de un sensor
 Receptor (reconocedor) Reconoce o evento
 Transductor (conversor) (físico o químico)
Convierte el evento
 Comunicador (transportador) en una señal
mensurable
Conduce la señal
mensurable hasta un
sistema de detección

transductor analito

Evento
Detector

Comunicador Reconocedor
 Clasificación de los sensores: De acuerdo
con el tipo de reconocedor

Sensores Sensores
Físicos Químicos

Apresenta reação
Apenas
química com o
Não há reação interações físicas:
analito, através
química. Luz, ondas
de moléculas ou
sonoras, calor
íons.
 Clasificación de los sensores: De acuerdo
con el tipo de reconocedor

Sensores Sensores
Físicos Químicos

Apenas Ocurre reacción

interacciones química con el
No hay reacción
físicas: Luz, analito, a través de
química.
ondas sonoras, moléculas o iones
calor
SENSORES IMITAN EL SISTEMA
SENSORIAL HUMANO
Elemento
reconocedor

Sensor Físico
Sensor Químico Visión
Olfato Audición
Tacto

Paladar
 SIMILITUDES ENTRE LOS SENTIDOS Y LOS SENSORES

Sensor

Analito / receptor / transductor- comunicador/detector

Nariz
Evento químico

Moléculas pequeñas/ membrana olfativa (proteinas)/ células nerviosas/ cerebro

Ojo
Evento físico

Luz visible/ conos e bastones (proteinas)/ células nerviosas/ cerebro

 transductor analito

Señal Señal E. Q.

mensurable química

Comunicador Reconocedor

Evento químico
Químicos
 Indicadores ácido/base (sensibles a variaciones
del pH)
 Intercambiadores iónicos
 Sustancias redox
 Ionóforos
 Catalizadores
 Sustancias fluorescentes (sensibles a
variaciones de la fluorescencia)
Receptores biológicos usados para
bio-reconocimiento
1. Enzima / sustrato
2. Proteína Receptora / ligante
3. Anticuerpo / antígeno
4. Ácidos Nucleicos : DNA / DNA o DNA / RNA

1 2 3 4
 transductor sustrato

Señal Señal R .BQ.

mensurable Bioquímica

comunicador componente
biológico

Evento bioquímico
UNA DEFINICIÓN MÁS AMPLIA PARA BIOSENSORES
G. Orellana, D. Haigh, Current Analytical Chemistry, 2008, 4, 273-295.

Originalmente, para definir a un biosensor era

considerado que el elemento de reconocimiento biológico
seria obtenido a partir de un organismo vivo (enzimas,
anticuerpos, material genético, etc.) o obtenido de
organismos completos (células, bacterias, hongos, etc.).

Actualmente, sistemas sensores que usan ELEMENTOS

DE RECONOCIMIENTO BIOMIMÉTICOS SINTÉTICOS
(molecularly imprinted polymers - MIP, péptideos,
aptámeros, compuestos redox….) también se les está
considerando como biossensores.
CLASIFICACIÓN DE LOS SENSORES: SISTEMAS TRANSDUCTORES
Analito

Fase Sensora: Evento de reconocimeinto selectivo

Energia de transducción

Electroquímica Electromagnética Térmica

amperométricos potenciométricos ópticos acústicos térmicos

Respuesta Procesamiento Lectura

 CLASIFICACIÓN DE LOS SENSORES:
SISTEMAS TRANSDUCTORES

 Electroquímicos (corriente, potencial,

conductividad, impedancia)

 Ópticos (color, fluorescencia, quimioluminiscencia)

 Calorimétricos (calor)

 Acústicos (frecuencia)

 Piezoeléctricos (masa)
Producción científica mundial relacionada a los varios tipos
de biossensores, extraída de la base de datos del ISI®
óptico
(Institute for Scientific information)
32%

óptico
32% piezoeléctrico
9%
piezoeléctrico
9%
térmico
5% térmico
eletroquímico 5%
54%
 Transductores electroquímicos

 Amperométricos Variación de la corriente

 Potenciométricos Variación del potencial

 Condutométricos Variación de la condutividade

 Impedimétricos Variación de la impedância

 Coulométricos Variación de carga

(BIO)SENSORES AMPEROMÉTRICOS
Medida de la variación de la corriente producida o
consumida:
AnalitoOX

Electrodo
+ne-
AnalitoRED

 En sensores: Por un compuesto redox y el analito.

 En biosensores: Por la reacción redox entre un ENZIMA

OXIDO-REDUTASA y su sustrato.

La corriente es proporcional a la concentración

del analito o del sustrato.
Características de los (Bio)Sensores Amperométricos

 Bajo costo
 Sensibilidad elevada
 Alta precisión
 Miniaturisables
 Fácil manejo e construcción

SENSORES: Poca selectividad 

Buena estabilidad 

BIOSENSORES: Alta selectividad 

Poca estabilidad 
Celda Electroquímica usada para las medidas amperométricas

T Electrodo de trabajo – sensor

Mantener el potencial del

ET constante R A
Mantener el ER inmune a las
variaciones de corriente

Constituida de un electrodo de referencia (R), un sensor (eletrodo de

trabajo, T) y un electrodo auxiliar (A) generalmente de Pt
 MATERIALES BIOLÓGICOS USADOS EN LA
CONSTRUCCIÓN DE BIOSENSORES
- Las más usadas propiedades catalíticas
- Manipulación relativamente simple
Enzimas
- Buena seletividad
- Relativamente de fácil adquisición

Anticuerpos alta selectividad y sensibilidad

Proteínas Receptoras afinidad y selectividad

Ácidos Nucléicos selectividad

Tejidos vegetales, micro-organismos, bacterias

ENZIMAS Y LA CONSTRUCCIÓN DE BIOSENSORES

Enzimas REDOX (reductasas, oxidasas)

Electrones producidos/consumidos en la reacción biocatalítica

TRANSDUCTOR AMPEROMÉTRICO

BIOSENSORES AMPEROMÉTRICOS
ENZIMÁTICOS
 MODELO LLAVE-CERRADURA
“LA LLAVE”
EL SUSTRATO

H2O

“LA CERRADURA”
EL SÍTIO ACTIVO
 Constante de Michaelis-Menten( K MM )
 Según la teoría de catálisis enzimática la K MM representa la
AFINIDAD que tiene una determinada enzima por su
sustrato.
 Cuanto menor su valor, MAYOR es la afinidad pelo sustrato.
 El sustrato ‘FAVORITO’ de la enzima tendrá un menor valor
de K MM, debido a que la velocidad máxima (VMAX) se alcanza
más rápidamente.

En el modelo matemático de Michaelis–Menten las velocidades

iniciales vs la concentración del sustrato (S), presentan una
relación hiperbólica:

VMax [S ]
V
([ S ]  K MM ) P1x
y
( x  P2 )
 Perfil Hiperbólico de la respuesta de Enzimas en
solución o inmovilizadas: Cinética de Michaelis-Menten

900
Velocidad inicial

VMax
600
2

300

VMax [S ]
K MM V
([ S ]  K MM )
0
0 200 400 600 800
-1
[Sustrato] / mol L
En el caso de enzimas inmovilizadas en biosensores
amperométricos: Se calcula la constante “aparente” de
Michaelis-Menten.

900

iMax
600 2
 i / nA

300
iMax [S ]
K app iS 
MM ([ S ]  K MM
app
)
0
Las velocidades 0 200 400 600 800
son reemplazadas -1
[S] / mol L
por corrientes
GRÁFICO DE LINEWEAVER-BURKER O DOBLE RECÍPROCO

iMax [S ]
iS 
([ S ]  K MM
app
)

1 [S ]  K app
MM

iS iMax [S ]

1 1  K MM
app
 1 
    
iS iMax  iMax  [S ] 
y  A  Bx
Cálculo de la Constante de Michaelis-Menten:
Gráfico del doble recíproco
-2
1,2x10

-3
9,0x10
2
-1
-1))
cm
(nA (A

-3
6,0x10
1/ Dj1/i

-3
3,0x10 1 1  K MM
app
 1 
    
i iMax  iMax  [S ] 
app
-1/KMM 0,0 -2 -2 -2
1,0x10 2,0x10 3,0x10
-1
1/[S] (mol L)
1/[S]
Cinética y eficiencia de la Transferencia de
electrones desde el sítio activo de la enzima para la
superfície del electrodo. Debido a la grande capa de
amino-ácidos alrededor del sítio activo del enzima
donde ocurren las reacciones redox

e-

e-
e-

e- e-
Electrodo
 EL sítio activo de la glicosa oxidasa – GOX (FAD:
FLAVIN-ADENINE DINUCLEOTIDE C27H33N9O15P2)

El sitio activo se
encuentra a una o
profundidad de 8 A,
de la superficie de la
molécula enzimática
BIOSENSORES AMPEROMÉTRICOS DE 1ª GENERACIÓN

Monitoreando la
reacción REDOX del
producto o reactivo

Potenciales muy altos, mucha interferencia en las medidas

BIOSENSORES AMPEROMÉTRICOS DE 2ª GENERACIÓN

Uso de mediadores de
electrones con potenciales
REDOX bajos
 CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOSENSORES
AMPEROMÉTRICOS DE 2ª GENERACIÓN
 Son los más comunes: Usan potenciales de
trabajo más bajos.
 Pueden presentar algunos problemas con
interferentes: A partir de la transferencia
electrónica de reacciones paralelas, que no son la
reacción de interés (enzima/sustrato)

 Pocas moléculas son disponibles y compatibles

con enzimas sin generar interferencia de reaciones
competitivas con el sustrato.

 Ejemplos: Ferroceno, tetracianoquinodimetano

(TCNQ).
BIOSENSORES AMPEROMÉTRICOS DE 3ª GENERACIÓN

Transferencia electrónica
directa, evitando el uso
de mediadores

 Promoviendo mayor selectividad.

 Operando en potenciales más aceptados por el enzima, se disminuyen las
reacciones interferentes y se evita el uso de otros reactivos en la
secuencia de las reacciones enzimáticas.
 Pocas enzimas pueden hacer esto. Ej. HRP y lacasa.
 EVALUACIÓN DEL TAMAÑO DE LA ENZIMA EN LA
RESPUESTA DE LOS BIOSENSORES AMPEROMÉTRICOS
T. Löbzbeyer, W. Schuhmann and H.L. Schmidt, Bioelectrochem. Bioenerg. 42, 1-6,1997

S S Hemina: sistema hierro-porfirina

S
CH2
H CH3
Hemina MM: 651.94
C
H3C
N CH2
N

e- e- e- e- HC Fe CH
N N
H3C CH3
C
S S
H
MP-11
COOH COOH

e- e-
MM: 36395.08

S
HRP
(enzima)

e-
 (i) Concentración de sitios activos aumenta
S S S significativamente, comparada con
enzimas grandes.
Hemina
(ii) Moléculas más pequeñas permiten una
mejor aproximación del sitio activo a la
e- e- e- e-
superficie electródica: AUMENTANDO LA
S S ATIVIDAD ELETROCATALÍTICA.

MP-11
(iii) Transferencia electrónica se puede
conseguir para enzimas grandes
e- e- /completas SOLAMENTE si hay una
orientación parcial del sitio activo en
dirección a la superficie del electrodo.
S
HRP
(iv) La difusión del sustrato desde la
solución para el sitio activo puede ser
impedida por la grande capa de
e- proteínas, cuando comparada a la
difusión usándose bio-catalisadores mas
pequeños, MENOS IMPEDIDOS.
 EVALUANDO EL TAMAÑO DE LA ENZIMA

 Disminuyendo o removiendo la “capa” protectora de

proteínas alrededor del sítio activo de la enzima:

1) Mejor y más eficiente transferencia electrónica,

será obtenida.

2) Manteniendo o mejorando la sensibilidad y

selectividad, tal como en los biosensores
enzimáticos construidos con enzimas.

3) Aumentando la estabilidad, y mejorando la robustez

de los sensores.
BIOSENSORES AMPEROMÉTRICOS DE 4º GENERACIÓN:
SENSORES BIOMIMÉTICOS

 Inicialmente bautizada como:

“Enzymeless Biosensors” o biosensores sin enzimas

 Actualmente se les conoce como Sensores Biomiméticos

 En estos sensores algún compuesto que cataliza especies

importantes de forma sensible y selectiva (tal como enzimas
en los biosensores), es inmovilizado en la superficie de los
electrodos.

 A estos compuestos que imitan al sitio activo descubierto de

metalo-enzimas son llamados CATALIZADORES
BIOMIMÉTICOS.
 CATALIZADORES BIOMIMÉTICOS
Compuestos con estructura análoga al sitio activo de
enzimas OXIDO-REDUTASAS

 Compuestos inorgánicos simples

 Complejos de metales de transición
 Complejos órgano-metálicos análogos o el propio:
Sitio activo descubierto de una enzima
 Co-factores enzimáticos

QUE PUEDAN IMITAR A ENZIMAS en la catálisis de

sustratos, después de ser inmovilizados en la superficie
de electrodos para obtener sensores amperométricos.
 CONSIDERACIONES USADAS PARA ESCOGER UM
COMPUESTO “CANDIDATO” A CATALIZADOR
BIOMIMÉTICO

 Conocerse BIEN la estructura del sitio activo de la

enzima que será mimetizada

 Conocer el ambiente químico alrededor del sitio ativo.

 Conocer profundamente las reacciones y los

mecanismos entre la enzima y el sustrato, que serán
imitados: Permitirá comprobar la BIOMIMETIZACIÓN
de la enzima modelo.
ESTUDIOS INDICATIVOS DE LA BIOMIMETIZACIÓN
DE SISTEMAS BIOMIMÉTICOS ENZIMÁTICOS

PARÁMETROS A SER EVALUADOS:

1. Perfil Hiperbólico
2. Obtención de valores de K MM app
, los cuáles deben
ser del mismo orden de magnitud de la enzima
inmovilizada.
3. Perfil catalítico y sus características.
4. Cálculo del número de electrones y de protones
transferidos, siguiendo los mecanismo de reacción
de la enzima modelo.
1. AVALIACIÓN DEL PERFIL HIPERBÓLICO
DEL SISTEMA BIOMIMÉTICO
-6
6x10

-6
5x10
i / A

-6
3x10

1,0 x 10 5 [VE ]
-6
2x10
i 
1,3 x 10 3  [VE ]
0
-4 -4 -4 -4 -3
0,0 2,0x10 4,0x10 6,0x10 8,0x10 1,0x10
[VE] / mol L
-1
K app
MM
2. OBTENCIÓN DEL VALOR DE LA CONSTANTE
APARENTE DE MICHAELIS-MENTEN
6
1x10

5
9x10
-1
/A
-1

5
i

6x10

5
3x10
app
KMM = 1,8 x 10-3 mol L-1
app -1 3 3 3 4
-(KMM) 0 3x10 6x10 9x10 1x10
-1 -1
[VE] / mol L
La cuál deberá ser OBLIGATORIAMENTE lineal cuando obtenida del
gráfico hiperbólico
3. PERFIL ELECTROCATALÍTICO Y SUS CARACTERÍSTICAS EN LOS
SISTEMAS BIOMIMÉTICOS

Sensor en la presencia de sustrato

sensor

v El pico en IIa
corresponde a una
electro-catálisis
oxidativa?
 MODELO TEÓRICO DE ANDRIEUX & SAVÈANT
J. Electroanal. Chem. 93 (1978) 163.

En este modelo teórico (derivado de la ecuación de Ilkovic)

la corriente de pico catalítica (Ip) depende de la raiz
cuadrada de la velocidad de barrido de potencial ():
1/ 2
 F 
I p  0,496 FACS D 1/ 2
0   1 / 2
 RT 
Cs: concentración de sustrato; Do: coeficiente de difusión
del sustrato; F: constante de Faraday; R y T son la
constante de los gases y temperatura en Kelvin.
Ejemplo de voltamograma cíclico en un determinado
pH a una determinada velocidad de barrido ()

20 Sustrato
Ep
15
j / (mA cm )
-2

10

5
Blanco

-5
0,0 0,1 0,3 0,4 0,6 0,8
Potential / (V vs Ag|AgCl)
CONSIDERANDO QUE UN SISTEMA CATALÍTICO:
A. Se comporta como un sistema totalmente irreversible;
B. Electroquímicamente controlado por difusión;
C. Con grandes valores de parámetros cinéticos:
representado pela constante de la velocidad de la reacción

Un gráfico de la jp (ip/A) vs  debe ser construido para

verificar a dependencia lineal entre esas variables
- La inclinación obtenida gráficamente será igual a:

1/ 2
 F 
inclinación  0,496FC S D 1/ 2
0  
 RT 

Puede ser calculado el coeficiente de difusión

 Dependencia lineal de la densidad de corriente en función de la raíz
cuadrada de la velocidad de barrido en sistemas catalíticos

1/ 2
 F 
25,4 x10 6
 0,496FC S D
1/ 2
0  
 RT 

1,8 x 10-5 cm2 s-1

Encontrar el coeficiente de difusión (Ds), para una concentración de 0,02 mmol L-1
(2 x 10-8 mol cm-3 ) y a 25 0C.
Considerando que la oxidación electrocatalítica se presenta
como una oxidación irreversible, la ecuación de Randles-Sevick
deberá ser usada para encontrar el número de electrones:

jp ( 2,99x105 )n [( 1  )na ]1/2 D10/2C * 1/2

Y = BX
jp = inclinación = 25,4 µA
cm-2 V-1/2 s1/2;
n: número total de electrones involucrados en la reacción;
: coeficiente de transferencia de electrones,
na: número de electrones involucrados en la etapa determinante;
D0 (cm2 s-1): coeficiente de difusión de la especie electro activa;
C*s: (mol cm-3) la concentración de la especie electro activa;
: velocidad de barrido de potencial.

Para encontrar “n” se debe encontrar “[1-)na]”, conociendo

previamente el coeficiente de difusión
Considerando que es necesario el valor de [(1-)na], un cálculo
aproximado se basa en el desplazamiento del valor del
potencial de pico anódico (Epa) en función de la .

Para sistemas irreversibles y/o catalíticos, el potencial de

pico anódico (Epa) es función lineal del log:

 1,15RT 
E pa    log
 [( 1   )na ]F 

Inclinación de la
recta Epa vs log

Como son aproximaciones muchas vezes tenemos también un

coeficiente lineal, lo importante es que se cumpla la relación
lineal.
 E pa( V )  0. 30  0. 050 log( V s 1 )

El gráfico indica una variación lineal con inclinación de 0.050,

para velocidades de varredura entre 0.010 e 0.300 V s-1
De la equación:
 1,15RT 
E pa    log
 [( 1   )na ]F 

Y del dato experimental:

E pa( V )  0. 30  0. 050 log( V s 1 )

Se puede calcular el valor de [(1-)na], considerando que

R=8.31 e T=298 K.

Respuesta: 0.59
 CALCULANDO EL NÚMERO DE ELECTRONES

jp ( 2. 99x105 )n [( 1  )na ]1/2 D10/2C * 1/2

Inclinación = 25,4 x 10-6

25. 4x106 ( 2. 99x105 )n( 0. 58 )1/2( 1. 8x105 )1/2( 2. 0x108 )

25. 4x10 6
n
( 2. 99x105 () 0. 58 )1/ 2( 1. 8x10 5 )1/ 2( 2. 0x10 8 )

n  1. 3 ~1. 0 electrón
CÁLCULO DEL NÚMERO DE PROTRONES TRANSFERIDOS
Gráfico del potencial de pico catalítico (Ep) vs pH
Por ejemplo, una relación
lineal con inclinación de  0.06
V/pH, indica una reacción
electródica proporcional de 1,
entre e- e H+.
- El número H+ involucrados en
el proceso será igual al de los
electrones.
- Así, si el número de
electrones determinado fuera
2, hay solamente la posibilidad
de que el número de H+ en
este proceso sea 2.

nH
En general se cumple a inclinación  0. 0592 ( V pH1 )
25 oC: ne 
 VERIFICANDO UN PROCESO DE OXIDACIÓN
ELETROCATALÍTICO
Gráfico de la corriente de pico normalizada por la raíz cuadrada
de la velocidad de barrido (ipa -1/2) vs 

Perfil característico de un proceso

tipicamente electroquímico-químico catalítico
(EC´cat) corroborando, la electro-catálise.
O + ne- R E tapa E letroquímica
k'
R +Z O +Y E tapa química
 SENSORES BIOMIMÉTICOS

Sustancia
redox Cataliza
(CATALIZADO sustratos
R Cuando importantes,
BIOMIMÉTICO) inmovilizada en como en los
que imita el la superficie de biosensores
centro activo algún electrodo normales:
de alguna Alta selectividad
METALO- y sensibilidad
ENZIMA
CARACTERÍSTICAS DE LOS SENSORES BIOMIMÉTICOS

Hacen posible la realización de análisis:

 Rápidos
 Selectivos
 Sensibles
 Confiables
 Baratos
 Durables
 Estables
En ambientes no adecuados para las enzimas
Posibilidad de miniaturización y de comprobación
de la mimetización a través de estudios
electroquímicos y del conocimiento del
mecanismo de reacción de la catálisis enzimática.
CARACTERÍSTICAS DE LOS SENSORES BIOMIMÉTICOS

 Rango de respuesta, similar a aquellas

observadas en los biosensores enzimáticos

 Respuesta más rápida que la de los biosensores.

 Óptima estabilidad, mucho mejor que la de los

biosensores.

 Sensibilidad y selectividad semejante a la de los

biosensores.

 Principalmente han mostrado ser una alternativa

viable a los métodos convencionales de análisis
como UV/vis y Cromatografía.
EVOLUCIÓN DE LOS “BIOSENSORES” AMPEROMÉTRICOS
Sensores Amperometricos
• BUENA estabilidad
• Buena sensibilidad
• POBRE selectividad
Reconocedor
altamente selectivo
pero sujeto a la
DESNATURACIÓN con
Biosensores Amperometricos
el pH o la temperatura • POBRE estabilidad
• Buena sensibilidad
• ALTA selectividad

SENSORES BIOMIMÉTICOS
 Poseen alta estabilidad y alta selectividad, debido al uso
de los CATALIZADORES BIOMIMÉTICOS
 Posibilitando el aumento de la robustez de los sensores
 CATALIZADORES BIOMIMÉTICOS
 Existen muchas METALO-ENZIMAS. Ej. HRP, P450,
tirosinasa, lacasa, entre otras.
 El centro activo es un complejo órgano-metálico.

N N N
N
+
Cu+ Cu Fe
N N N N

deoxy reduzida
Estructura del sitio activo COOH
COOH
de la tirosinasa: Complejo
de cobre y nitrógeno Estructura del sitio activo de
la P450: Hierro-porfirina

 Un gran campo de acción que puede ser explorado para la

construcción de los sensores biomiméticos.
 ALGUNOS SENSORES BIOMIMÉTICOS DESCRITOS
EN LA LITERATURA
Enzima Catalizador biomimético Sustrato
Dopamina -
Ftalocianina de cobre e histidina (His) Dopamina
monooxigenasa
Tirosinasa Cu(bipy)Cl2; [Cu(bipy)2]Cl2 y [Cu(bipy)3]Cl2 Dopamina

Peroxidasa FeT4MpyP/His; Hemoglobina; MnO2; MnPc; Catecol, H2O2,

DA y Glutamato
Azul de Prússia
Órgano-haluros y
Citocromo P450 CoTphP; FeTPyPz paracetamol
Complejo dicúprico e N,N´,N”-[tris-(2-
Catecol oxidasa Hidroquinona
piridilmetil)-N-(2-hidroxi-3,5-di-tert-butilbenzil)-
1,3-propanidiamina-2-ol)
Complejo binuclear de Fe2+/Fe3+ com 2-(bis[{2-
Fosfatasa ácida Dopamina
púrpura
piridilmetil)-aminometil}-6-{(2-hidroxibenzil)(2-
piridilmetil)}-aminometil]-4-metilfenol

FeT4MpyP: Tetra-N-metil-piridil porfirina de hierro (III); CoTphP:

tetrafenilporfirina de cobalto (II); FeTPyPz: tetrapiridinoporfirazina de hierro (III)
 Especie Rango de
Sustrato KM M Aplicación
catalizadora respuesta

Complejo de Jugos de frutas

poli-histidina 3 - 300 mol L-1 1.3 mmol L-1
O O CHOHCH2OH y bebidas
de cobre
HO OH
Cu2+ inmovilizado Pastillas
en membrana 5.6 - 370 mol L-1 No dado
Ácido ascórbico de Vitamina C
de EVA

Cu2+ imobilizado
Fórmulas
HO NH2 em membrana 1 - 10 mmol L-1 No dado
farmacéuticas
de EVA
HO
Tetrapiridilporfirina
Dopamina de cobalto (III)
0.2 – 0.7 mol L-1 No dado Sin aplicación
modificada com 4
grupos [Ru(bipy)2Cl]
O

N
N
Óxido Para verificar
0.1 - 1 mmol L-1 1.2 mmol L-1 la calidad en
N N doble
H de Ru y Pb pescados
Hipoxantina

Glicosa 0.1 – 10 mmol L-1

Oxi-hidroxido
H2O2 0.6 – 3.96 mmol L-1 Sin aplicación
de niquel (I) No dado
Lactato 0 – 3.3 mmol L-1
NiI-O-O-H
Ascorbato 0.13 – 0.65 mmol L-1

En la construcción
H2O2 Azul de Prúsia 0.1 - 100 mol L-1 No dado de sensores
bienzimáticos
SISTEMAS BASADOS EM CUPRO-
ENZIMAS
 SISTEMAS BASADOS EN LA ENZIMA
DOPAMINA -MONOOXIGENASE (DM)
M.D.P.T. Sotomayor, A.A. Tanaka, L.T. Kubota, Anal. Chim. Acta 455, 215-223, 2002

H2O X
CuBII
HIS HIS
Met S

HIS HIS
CuAII
HIS H2O

Estrutura del sitio activo de la enzima DM

Mecanismo catalítico de la DM para la oxidación de Dopamina

R:H2N

Cu(II)
COMPUESTOS USADOS EN LA PREPARACIÓN
DEL SENSOR BIOMIMÉTICO

N
O
N N
+ N OH
Cu N
N NH2
N N N
N H
Histidina (HIS)
Ftalocianina de cobre (PcCu)

USADOS PARA PREPARAR UN SENSOR DE PASTA DE

GRAFITO MODIFICADA.
 PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR LA PASTA DE GRAFITO
•100 mg de grafite em polvo
1 mL de búfer fostato
Secar a To
•15 mg de complejo 0.1 mol L-1 e pH 7.0
ambiente
(homogenización)
•90 mg de aminoácido

Nujol
aglutinante

1 mm de
profundidad
Pasta de grafito
modificada
 MEDIDAS EN ELECTRODO ESTACIONARIO

Pasta sin modificar

Pasta modificada con PcCu

Pasta modificada con

PcCu conteniendo a la
HIS en solución
Pasta
modificada con
PcCu:HIS

Potencial aplicado: −100mV vs. SCE. Búfer fosfato 0.25 mol L−1
(pH 6.9) conteniendo 120 µmol L−1 de H2O2.
MEDIDAS EN CONDICIONES HIDRODINÁMICAS

Potencial aplicado: −100mV vs. SCE. Búfer fosfato 0.25 mol L−1
(pH 6.9) conteniendo 120 µmol L−1 de H2O2. Rotación: 100 rpm
 PARÁMETROS CONSIDERADOS EN LA
OPTIMIZACIÓN DE LA RESPUESTA DEL SENSOR

EFECTO DE LA [H2O2 ] EN LA SENSIBILIDAD DEL SENSOR. Eapl: −100 mV vs.

SCE, en búfer fosfato 0.25 mol L−1 (pH 6.9).
INFLUENCIA DEL POTENCIAL APLICADO en la respuesta del sensor para catecol.
Medidas realizadas en búfer fosfato 0.25 mol L-1 (pH 6.9) conteniendo 120 mol L−1
de H2O2.
INFLUENCIA DEL pH en la respuesta del sensor. Medidas realizadas en
búfer fosfato 0.25 mol L-1 conteniendo 120 mol L−1 H2O2 y Eapp: -100 mV.
PERFIL DE LA SELETIVIDAD DEL SENSOR BIOMIMÉTICO

Sustrato fenólico Respuesta Límite de detección app

K MM (mmol L-1)
obtenida (%) (mol L-1)

OH
100 9 0.80  0.02
OH

H2N OH
80 11 1.10  0.05
OH
OH
54 16 0.50  0.02
OCH3

HO NH2

N
41 24 n.d.
H
OH
28 29 n.d.
Mecanismo propuesto para la respuesta del sensor biomimético
basado en el sistema CuPc/His imitando a la DM

H2O2 (1)
H+

Cu2+ Cu2+- O-O-H

H+

OH
(2)
2H2O OH

2e- O
(3) 2H+
 SENSORES AMPEROMÉTRICOS PARA DOPAMINA A BASE DE
CATALIZADORES BIOMIMÉTICOS DE LA ENZIMA TIROSINASA,
IMOBILIZADOS EN MEMBRANA DE NAFION®

ENZIMA TIROSINASA (Tyr)

A B

Cu azul Cu O
Enzima multi-cúprica N
complejado
más estudiada Posee un sitio activo binuclear de
cobre (CuA and CuB) rodeado por
átomos de N
 METALO-ENZIMA QUE CATALIZA

orto-Hidroxilación
de mono-fenoles ACTIVIDAD MONO-FENOLASA

OH OH
OH
+ O2 + 3H+ Tirosinase + H2O

R R
Tirosina DOPA
 Oxidación de o-
ATIVIDAD CATECOLASA
difenoles a o-quinonas

OH O
OH O
Tirosinase
+ 2H+

R R
DOPA DOPAquinona
 O
N O N H+ OH
2+ 2+
Cu Cu
N O N
Forma ativa
O O
oxy-T
N N N O N
2+ 2+ 2+ 2+
Cu Cu Cu Cu
N O N N O N
H
oxy
met-D

+
H
+
2H
O2
+ H2O
H2O2
O O

N N N N
+
Cu+ Cu
2+ 2+
- Cu Cu
N N 2e N N
deoxy reduzida (Eletrodo) deoxy oxidada
Forma nativa
 ACTIVIDAD
CATECOLASA
 COMPUESTOS USADOS EN LA PREPARACIÓN DE
LOS SENSORES BIOMIMÉTICOS

OH2
Dipy 1:1 Dipy 1:2
Cl N OH2
2+
Cu N N
N
Cl 2+
Cu
N N
Cl N
2+
Cu
N
Cl [Cu(dipy)2]Cl2

Cu(dipy)Cl2 BIS-DIPIRIDIL DE COBRE (II)

DIPIRIDIL DE COBRE (II)

N
N N
2+
Cu
N N
N

[Cu(dipy)3]Cl2
Dipy 1:3
TRIS-DIPIRIDIL DE COBRE (II)
 MOLÉCULA DE NAFION®

 Polímero con alta densidad electrónica (negativamente

cargado).
 Insoluble en agua y soluble en alcohol
 Forma películas estables con moléculas POSITIVAMENTE
CARGADAS, como los complejos anteriores.
 PREPARACIÓN DEL SENSOR: PELÍCULA DE
NAFION® DOPADO CON COMPLEJO DE COBRE

Secado a la
Temperatura
ambiente

Electrodo Adición de 75 L de Sensor

de carbono solución conteniendo
vitreo limpo complejo de cobre
Voltamogramas cíclicos típicos mostrando la diferencia de potenciales de
pico obtenida con el electrodo de carbono vitreo después de la limpieza
mecánica con alúmina. [K3[Fe(CN)6] = [K4[Fe(CN)6] = 5,0 x 10-3 mol L-1.
-1
Tampão fosfato 0,1 mol L (pH 5,0)
Adição de soluções de Ferri/Ferrocianeto
200 de potássio

Epa = 0,42 V
100

i(A)
0

-100
Epc = 0,32 V

E permitido  100 mV
-0,4 0,0 0,4 0,8 1,2
Potencial vs Ag|AgCl (V)
EJEMPLO: SENSOR PARA DOPAMINA EXPLORANDO EL COMPLEXO
[Cu(Dipy)2]Cl2 {CLORETO DE BIS-DIPIRIDIL DE COBRE (II)} COMO
CATALIZADOR BIOMIMÉTICO DE LA Tyr, INMOVILIZADO EN
ELECTRODO DE GRAFITE VÍTREO EN MEDIO ANAERÓBICO.

8 Epa = -10 mV
Sensor
4
-2
j / mA cm

0 Electrodo sin modificar

-4

N N
2+
-8 Cu
N N

-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4

Potential vs SCE / V
PERFIL DE LA RESPUESTA DEL SENSOR DE [Cu(bipy)2]Cl2
EN LA PRESENCIA DE DOPAMINA.  = 10 mV s-1.
Respuesta amperométrica para DOPAMINA, obtenida en búfer
fosfato conteniendo 250 mol L-1 H2O2 Eapl = -50 mV vs SCE

Electrodo
-150 Modificado con
membrana de Nafion
j / nA cm -2

-300

65 mol L-1 de DA Electrodo modificado con

membrana de Nafion®
-450 dopada con
[Cu(Dipy)2]Cl2

-600
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Tempo / min
 Influencia de la presencia de H2O2 en la respuesta
del sensor a base de [Cu(Dipy)2]Cl2
0
[DA] = 35 mol L-1
Ausencia de H2O2
-100
-2
j / nA cm

-200 [H2O2] = 250 mol L-1

[DA] = 35 mol L-1

-300

-400

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8

Tiempo / min
Respuesta amperométrica obtenida en búfer fosfato a pH 7.0. Eappl = -50 mV
vs SCE.
 Características de los sensores biomiméticos
en la determinación de Dopamina

Catalizador biomimético
Parámetro
[Cu(Dipy)Cl2] [Cu(Dipy)2] Cl2 [Cu(Dipy)3]Cl2

Sensibilidad
(nA L mmol-1cm -2) 350 2000 1450

Límite de detección
9.0 8.0 4.8
(mol L-1)
app
K MM (mmol L-1) 0.8 0.4 0.3
 600
NH2
Respuesta relativa %

500
OH
OH

400 NH2
OH

300 NH2

HO NH2
200 HO

HO

100 HO
NH2
HO COOH

HO

0
pAF HQ pFDA DA CAT L-DA mAF SER FEN GUAI SAL oAF oFDA pNF mNF oNF

Compuesto fenólico
E = -50 mV vs SCE

H2O2

2H+

Cu2+
Cu24+ O O
OH Mimetizando
2+
Cu
2e- la actividad
Cu22+
H2O monofenolasa
O

H2O2 2e- O

2H+
Cu2+ OH
Cu24+ O O
2+
Cu
2e- +
OH
Mimetizando
H2O, H
Cu2+ Cu2+ O la actividad
Cu22+
O O O catecolasa
2H+
O H
+
2e-
H2O, H

HO

HO
OTROS CATALISADORES BIOMIMÉTICOS Y SUS
PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS EN LA
DETERMINACIÓN DE LA DOPAMINA

ENZIMA CATALIZADOR Sensibilidad Límite de Detección

MODELO BIOMIMÉTICO (nA l mol-1 cm-2 ) ( mol l-1)

DM [CuPc/His] 3.7 11.0

Tyr [Cu(Dipy)2Cl2] 2.0 8.0

HRP [FeT4Mpyp/His] 166.5 0.1

DM: Dopamina -monooxigenasa; Tyr: Tirosinasa; HRP: Peroxidasa de

raíz fuerte; CuPc: Ftalocianina de cobre; HIS: Histidina
 OTRAS POSIBILIDADES
COMPLEJOS METÁLICOS CON LIGANTES MULTI-PIRIDIL

M
N

2 N
N
2 M
N

HEXAPIRIDIL M
N

+ Cu

Cu

TETRAPIRIDIL

Cu

+ Cu
Cu Cu
SISTEMAS BASADOS EN HEME-
ENZIMAS
Muchos enzimas REDOX….……HEMINO
CH2
H CH3
C
H3C
N CH2
N
HC Fe CH
N N
H3C CH3
C
H

COOH COOH
Hierro proto-porfirina, o proto-hemina IX, o hemina b.
Sitio activo común de todas las P450
 P450

Ampliación del sitio activo

N
N
Fe

N
N

http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
HRP

Ampliación del sitio activo

N
N
Fe
N
N

http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
PORFIRINAS Y FTALOCIANINAS COMO CATALIZADORES
BIOMIMÉTICOS DE HEME-ENZIMAS
Estructura básica de las
ftalocianinas

N N

Fe

N N

HIERRO-HEMINA

Estructura básica de las porfirinas

 Sensor biomimético para determinación de compuestos
fenólicos a base de tetra-(N-metil-piridil)-porfirina como
catalisador biomimético de la HRP
F.S. Damos, M.D.P.T. Sotomayor, L.T. Kubota, A.A. Tanaka. Analyst, 2003, 128, 255–259
CH3
N

N N
N N
Fe
H3C N Fe N CH3
N N N N

N
CH3

HRP (horseradish
FeIIIT4MpyP peroxidase)
 Mecanismo de la reacción bio-catalítica
-2e-
HRP(Fe3+) + H2O2 Compuesto I + H2O (1a)

Compuesto I + AH2 Compuesto II + AH* (1b)

Compuesto II + AH2 HRP(Fe3+) + AH* + H2O (1c)

AH2 : Donador de electrones: Compuesto fenólicos, aminas, catecolaminas, etc.

(1a) Formación del compuesto I: ión oxo-ferril porfirina (O=FeIV, P+ ) apartir de
la oxidación via 2 electrones del FeIII del grupo hemino.

En los biosensores:

Potencial
AH* + H+ + e- AH2
 PREPARACIÓN DEL SENSOR

Secado a Secado a
Temperatura Temperatura
ambiente ambiente

Electrodo de Adición de 30 L de Adición de 75 L

carbono solución conteniendo de solución Sensor
vítreo limpo 1,5 g L-1 de HIS e conteniendo 1,6%
0,75 g L-1 de (m/v) de Nafion®
FeIIIT4MpyP en DMF
RESPUESTA AMPEROMÉTRICA PARA CATECOL

Electrodo con membrana de Nafion®

Electrodo con membrana de

Nafion® y FeIIIT4MpyP

Electrodo con membrana

de Nafion® dopada con
FeIIIT4MpyP e HIS: sensor
biomimético

Electrólito: Búfer succinato 0.1 mol L-1 (pH 4.0) conteniendo 750 μmol L-1 de H2O2.
Potencial aplicado: 0 mV vs. SCE.
Influencia de la presencia de H2O2 en la respuesta del sensor

Señales obtenidos en la ausencia (a) y presencia (b) de 100 μmol L-1 de H2O2. Medidas
realizadas en búfer succinato 0.1 mol L-1 (pH 4.0), Eappl: 0 mV vs. SCE.
 Evidencias de la biomimeticidad

PRIMERA: Hay la formación espontanea del intermediario oxo-

ferryl porfirina (O=FeIV) a partir da reação do FeIIIT4MpyP (a)
com H2O2 (b).
 Cinética de Michaelis-Menten

SEGUNDA: Perfil de respuesta hiperbólica, tal como observado

en biosensores a base de enzimas.
SELECTIVIDAD
 Posible mecanismo de la reacción biomimética

(Fe3+,P) + H2O2 (O=Fe4+, P+) + H2O (2a)

(O=Fe4+, P+) + Phred (O=Fe4+, P) + Phox (2b)

(O=Fe4+, P) + Phred + 2H+ (Fe3+, P) + Phox + H2O (2c)

En el sensor biomimético:

Potencial
Phox + e- Phred

Ph: Compuesto fenólico

Esquema del Mecanismo de Respuesta del Sensor

Este número de
electrones es el
que será
proporcional a la
concentración de
fenol

Transferencia mediada de electrones usando compuestos fenólicos

 LA ENZIMA P450

Proto-
porfirina de
hierro IX
En solución:
Diversas Ampliamente
porfirinas han
demostrado distribuida en
biomimetizar la naturaleza
a la P450

Química y Catalizan varias

estructura muy reacciones en
bien conocidas organismos
CATALISAM VÁRIAS REAÇÕES NOS ORGANISMOS
(a) Hidroxilação de hidrocarbonetos

1 P450
CH + /2O2 C OH

(b) Dehalogenação oxidativa

R2 R2 R2
P450
R1 C X R1 C X R1 C O + HX
H OH

(c) N-hidroxilação

1 P450
C NH2 + /2O2 C NHOH

(d) N-oxidação

1 P450
N + /2O2 N + O-
(e) Redução de N-óxidos

+ - P450
N + O- + 2H + 2e N + H2O

(f) Oxidação de álcoois

R´(H) R´(H)
P450
R C OH + 1/2O2 R C O + H 2O
H

(g) Dehidrogenação acíclica

H2 H H
C -H C - e-, - H+ C
C C C
H2 H2 H

(h) Dehalogenação redutiva

R2 -
R2
+e
R1 C X R1 C + X-
R3 R3
 SENSOR BIOMIMÉTICO PARA DETERMINAÇÃO AMPEROMÉTRICA
DE PARACETAMOL, BASEADO NA ENZIMA CITOCRÔMIO P450
Sotomayor, M.P.T.; Sigoli, A.; Lanza, M.V.; Tanaka, A., Kubota, L., J. Braz. Chem. Soc. 19, 734-743, 2008.

Comparación delas estructuras del sitio activo de la P450 y del

catalizador biomimético usado

N N
N N N N
Fe
N Fe N
N N
N N
N N

COOH COOH

FeTPyPz
P450
LA FeTPyPz IMITA A LA P450 EN LA OXIDACIÓN DEL PARACETAMOL

NHAc NAc
- 2e-, - 2H+
HO P450 ou FeTPyPz O

El paracetamol es metabolizado por la P450 a través de una reacción de

deshidrogenación cíclica
El N-acetil-p-aminofenol (acetaminofenol o paracetamol) es oxidado para
una N-acetilbezoquinona-imina (NAPQI), a través de la perdida de dos
protones y dos electrones.

Molécula modelo para obtener un sensor biomimético

basado en la enzima P450, cuyo mecanismo y química
son bien conocidos
 PREPARAÇÃO DO SENSOR

Secagem à
Temperatura
ambiente

Eletrodo de Adição de solução

carbono contendo Nafion e
Sensor
vítreo limpo FeTPyPz
 Evidencias experimentales de la biomimeticidad
1) Perfil catalítico
Epa = 448 mV
[Par] = 450 mmol L
-1
20

15
j / (mA cm )
-2

10

5
Blanco

-5
0,0 0,1 0,3 0,4 0,6 0,8
Potential / (V vs Ag|AgCl)
Perfil catalítico para paracetamol. Blanco: búfer acetato 0.1 mol L-1 (pH 3.6)
2) Verificando el proceso de Electroelectro-oxidación catalítica
1,7

s )
1/2
-1/2
1,6

/ (A cm mV
-2
1,5

1,4
-1/2
j v

1,3

0 5 10 15 20 25 30
-1
v / (mV s )
Reacción química (C)
NHAc NAc
Fe(III)TPyPz + Fe(II)TPyPz +
HO O

Reacción electroquímica (E)

Fe(II)TPyP Fe(III)TPyP + 1e-
3) Cálculo da constante aparente de Michaelis-Menten
-6
6x10

-6
5x10
i / A

-6
3x10

-6
2x10

0
-4 -4 -4 -4 -3
0,0 2,0x10 4,0x10 6,0x10 8,0x10 1,0x10
-1
[Analito] / mol L

Ejemplo del perfil hiperbólico esperado para la respuesta de

sensores biomiméticos, similares a los biosensores enzimáticos
 8,0

6,0

i / (A )
-1
-1

4,0

2,0
app app
1/KMM
K MM = 2,15 x 10-2 mol L-1

3 4 4 4
0,0 5,0x10 1,0x10 1,5x10 2,0x10
-1 -1
[Paracetamol] / (mol L)

Gráfico de Lineweaver-Burk para la electro-oxidación catalítica de

paracetamol con el sensor basado en el complejo FeTPyPz.
4) Calculando el número de electrones

Scan: 0.1 mV s-1

-7 [Par] =420 mol L-1
6x10

-7
4x10
iL
i/A

-7
2x10

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

Potencial vs Ag|AgCl / V

Bard, A.J.; Faulkner, L.R.; Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications, 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc.: New York, 2001.
 Potential / (V vs. Ag|AgCl)
0,6

0,5

0,4
R=0,994

-6 -3 0 3 6
ln [(iL - i) / i]

Encontrando un número de electrones = 1,6 ~2 electrones

5) Dato Adicional: Cálculo del coeficiente de difusión
5.1) Verificando si el proceso es controlado por difusión
8,0
j pa / (A cm )
-2

6,0

4,0

2,0

1 2 3 4 5 6
1/2 1/2 -1/2
v / (mV s )
Dependencia de la densidad de corriente de pico anódico (A cm-2) con la raíz
cuadrada de la velocidad de barrido (v1/2) para a electro-oxidación de paracetamol
La ecuación que ajusta linealmente a los datos de la recta es:

j (A cm-2) = 0,42(± 0,06) + 1,22(±0,02) v1/2 (mV s-1)1/2

5.2) Calculando el coeficiente de difusión

De la ecuación de Randles-Sevcik:

jp = 2,99 x 105 [(1-)na]1/2nD1/2C* v1/2

Inclinação da reta
1.066 x 10-6 cm2 s-1
jp = Densidad de corriente de pico, A
n = número de electrones de la reacción entre el analito y el eletrodo
D = coeficiente de difusión, cm2 s-1
C = concentración, mol cm-3
v = velocidad de barrido, V s-1
na = número de electrones en la etapa de transferencia de carga.
 = coeficiente de transferencia electrónica
Propuesta del Mecanismo de Respuesta del Sensor

NHAc

2Fe(III)TPyPz

HO
Electrodo

2e -

NAc

2Fe(II)TPyPz
+ 2H+

O
N-acetilbezoquinona-imina
(NAPQI)
Resumen de los parámetros analíticos e cinéticos del sensor en el bath mode

Parameter Response
Linear range (mol L-1) 4.0 x 10-6 to 4.2 x 10-4
Sensitivity (A L mol-1) 5798 ± 73
Correlation coefficients 0.9994 (n = 10)
Detection limits (mol L-1) 1.2
Quantification limits (mol L-1) 4.0
Repeatability (RSD, n=7; [Par] =2.4x10-4 mol L-1) 3.4
Sensor reproducibility (RSD, n = 4) 5.0
Applied potential [mV vs Ag|AgCl(KClsat)] 450
Response time (s) 0.5
Sensor lifetime (days) 180
Operational stability (measurements) 50 (kept 95% signal)
Paracetamol diffusion coefficient (cm2 s-1) 1.066 x 10-6
Apparent Michaellis-Menten constant (mol L-1) 2.15 × 10-2
Electrons transfer 2
 OPTIMIZACIÓN DEL SISTEMA FIA
0.24
500 mV

0.16
i (µA)

Efecto del flujo

0.08

1.8
Influencia del
0.00 potencial aplicado
1.5
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

i (A)
Potential (V) vs Ag|AgCl(KClsat) 1.2

3.5 0.9

3.0 0.6
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
i ()

-1
2.5 Flow rate (mL min )

2.0
Influencia del
volume de amostra
1.5 inyectada Las barras de errores
0 50 100 150 corresponden al desvío estándar
Vi (L) de siete análisis de
1,0 x 10-4 mol L-1 de paracetamol
 80
i
e
70 2

60

i (µA)
d
1

50
c
h b
h a
0
i (µA)

40 Tempo (s)
1000

30

g g
20

f f
10
e e
a b c d d
0
0 1000 2000 3000 4000
Tempo (s)
FIAGRAMA obtenido para el sensor biomimético en un sistema en flujo, con diversas
concentraciones de paracetamol. [Paracetamol]: a = 1.0 x 10-5 mol L-1; b = 5.0 x 10-5
mol L-1; c = 1.0 x 10-4 mol L-1, d = 5.0 x 10-4 mol L-1; e = 1.0 x 10-3 mol L-1; f = 5.0
x 10-3 mol L-1; g = 1.0 x 10-2 mol L-1; h = 2.5 x 10-2 mol L-1 and i = 5.0 x 10-2 mol L-1
 6

i / A 4

3 a

0
0 10 20 30 40 50
Number of assay
ESTABILIDAD EN FLUJO: Respuesta relativa obtenida para inyecciones
sucesivas de 1.0 x 10-3 mol L-1 de paracetamol, en función del número de
experimentos. (a) Condicionamiento del sistema. Cada punto corresponde a la
media de 8 inyecciones.
Parámetros analíticos del sensor en el sistema FIA
Parameter Response
Applied potential vs Ag|AgCl(KClsat) 0.5 V
Flow rate (mL min-1) 1.25
Vi (µL) 75
Linear range (mol L-1) 1.0 x 10-5 – 5.0 x 10-2
Sensitivity (µA L µmol-1) 2579 ± 129
Quantification limits (µmol L-1) 1.7
Detection limits (µmol L-1) 0.5
Measurement repeatability (RSD, n = 7
1.2%
and [Paracetamol] = 4.0 x 10-4 mol L-1)
Sensor reproducibility (RSD, n = 3) 5.0 %
Operational stability (kept 93% of the
320 measurements or 5 d
initial signal)
Analytical frequency 51 samples h-1
 Aplicación del sensor en flujo en el análisis de remedios

Experimental value
Sample Label value Official Proposed
Erro (%)
method sensor
mg mL-1

Tylenol®(FL121, 04/11) 200 190 196 + 3.2

Paracetamol (0804193, 08/10) 200 197 203 + 3.0

Tylenol®(FL169, 04/10) 160 mg /5 mL 162 163 + 0.6

Tylenol® (AL008, 11/09) 100 92 96 + 4.3

mg / Tablet

Tylenol DC (CL008, 1/11) 500 500 488 - 2.4

Tylenol AP (FL105, 2/10) 650 656 680 + 3.6

Paracetamol (15655, 5/10) 750 765 800 + 4.6

 Aplicación del sensor en flujo en el análisis de ríos
80 2
2
A E
B C
i F
D
d A D
70

i (A)
B

i (A)
0
C E F
c
a b
0
6000 7000

60 Tempo (s)
Tempo (s)

50
h h
i (A)

40

30
g
g
20

f f
10
e e
d d A D C E F B
0
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

Tempo (s)
Seis aguas der rios enriquecidas en 2 níveles de [paracetamol]. A – F: 5.0 x 10-2 mol L-1
e A´ - F´: 1.0 x 10-4 mol L-1. A y A´: Río Tietê en el club Usina da Barra; B y B´: Río Tietê
en el límite con la ciudad Igaraçu; C y C´: Río Tietê en el puente de la ciudad Barra
Bonita; D y D´: Río Jacaré Guaçú; E y E´: Río Jacaré Pepira; y F y F´: Río Jaú.
 Valores de recuperación para paracetamol en las
aguas de los ríos

% Recovery
Río
FIA* HPLC

Jacaré Pepira 100.0 ± 2.0 96

Jacaré Guaçú 96.4 ± 3.6 94

Jaú 99.8 ± 1.3 96

Tietê en el límite con la ciudad Igaraçu 97.8 ± 1.9 94

Tietê en el puente de la ciudad Barra Bonita 96.9 ± 0.5 94

Río Tietê en el club Usina da Barra 95.8 ± 5.6 92

*Media de los dos niveles de concentración
Aplicación en el monitoreo on-line en procesos de degradación
electroquímica de fármacos usando un ánodo de DSA-Cl®

Resultados
prévios en
batch

Análisis hechos
después de
varios dias
 Sustituir
SISTEMA EN FLUJO ADAPTADO A UNA esta celda por
CELDA ELECTROQUÍMICA
um reactor
PARA LA DEGRADACIÓN DEL electroquímico
PARACETAMOL
de bancada al nível piloto
 REACTOR ELECTROQUÍMICO DE BANCADA AL NIVEL PILOTO

C
E

Representação esquemática do reator eletroquímico de bancada (A) acoplado ao sistema

de recirculação composto pelo reservatório (D) com um amostrador (E); pela bomba
hidráulica (C) e pelo rotâmetro (B)
 SISTEMA FIA:
CARRIER: K2SO4 0,1 mol L-1,
FeSO4.7H2O 5,0x10-4 mol L-1.
FLOW RATE: 1.25 mL min-1 io
INJECTION VOLUME: 75 µL
5 0,5

i (A)
4

3
i (A)

0,0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
1
TEMPO (s)

PARA ELECTROLISIS:
ELECTROLYTE: K2SO4 0.1 mol L-1,
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
TEMPO (s) FeSO4.7H2O 5,0x10-4 mol L-1.
[Paracetamol]o : 1.35 x 10-2 mol L-1
Δi  0,03  111,6[Paracetamol]
DSA-O2® anode (area: 0.8 cm2)
Ielectrolysis: 0,24 A cm-2
 0,8 t0
a1 a
2 a3
a4 a
5
0,6 a6
a7 a8
a9
i / µA

0,014

-1
A
µ
a10
/

[Paracetamol] / mol L
i

0,4
0,012

0,2
0,010

0,0
0 2000 4000 6000
0,008
Tempo / s
0 20 40 60 80 100
Señales FIA vs t, para la degradación del
paracetamol aplicando corriente de 0,20 A. Tempo / min
Electrodo de trabajo DAS-O2. to: tiempo inicial
de electrolisis – sin aplicar corriente. a1 – a6: Perfil de la curva de decaimiento
corresponden a alícuotas muestradas a cada 5 de la [Paracetamol] vs tiempo de
min; a7 – a9: corresponden a alícuotas de degradação. Corriente de 0,20 A
muestras amostradas en 40, 50 y 60 min,
respectivamente; a10: corresponde a una
(0,25 A cm-2)
alícuota muestrada a los 90 min. de electrólisis.
[Paracetamol]0 = 1,35 x 10-2 mol L-1 (2041,2
ppm).
 ln[Paracetamol]  4,31  0,00751min
-4,2 R  0,9960

ln[Paracetamol]
-4,4

-4,6

-4,8

-5,0

-20 0 20 40 60 80 100
Tempo / min

Perfil linear da cinética de pseudo-primeira ordem da degradação de paracetamol

em cela contendo eletrodo DSA-O2. Corrente aplicada = 0,20 A (0,25 A cm-2).

ln[Paracetamol]  kt  ln[Paracetamol]o

O coeficiente linear da reta corresponde a: ln[Paracetamol]o  4,31

Dando o valor de 0,0134 mol L-1 de paracetamol inicialmente adicionado na cela de

eletrólise. E o coeficiente angular corresponde à constante aparente de pseudo-
primeira ordem: 0,00751 min-1.
 Valores da concentração de paracetamol na degradação eletroquímica com ânodo DSA-O2® em
potencial de eletrólise 0,2 A, obtidos através do método FIA com detector amperométrico (sensor
biomimético) e cromatográfico (referência).

Tempo de eletrólise / min [Paracetamol] / mol L-1 Erro / %

Sensor - FIA HPLC

0 0,0135 0,0135 ---

5 0,0130 0,0124 + 4,8

10 0,0126 0,0130 - 3,1

15 0,0118 0,0132 - 10,6

20 0,0115 0,0128 - 10,2

25 0,0114 0,0117 - 2,6

40 0,0098 0,0110 - 10,9

50 0,0093 0,0092 +1,1

60 0,0086 0,0079 +8,9

90 0,0077 0,0072 + 6,9

 0,014
-1
[Paracetamol] / mol L

0,012

0,010

Perfil de la curva de decaimiento

de [Paracetamol] vs tiempo de
degradação. Corriente de 0,20 A
0,008

(0,25 A cm-2) obtenida com el

sensor biomimético.
0 20 40 60 80 100
Tempo / min
Perfil da curva de [Paracetamol] em 0,014

-1
[Paracetamol] / mol L
função do tempo de degradação a uma
corrente de 0,20 A (0,25 A cm-2), onde 0,012
a concentração de paracetamol foi
obtida pelo método cromatográfico
0,010
oficial de análisis.

0,008

0 20 40 60 80 100
Tempo / min
Valores da concentração de paracetamol na degradação eletroquímica com ânodo
DSA-Cl2® em potencial de eletrólise 0,4 A, obtidos através do método FIA com
detector amperométrico (sensor biomimético) e cromatográfico (referência).

Tempo de eletrólise / min [Paracetamol] / mol L-1 Erro / %

Sensor - FIA HPLC

0 0,0135 0,0135 ---

10 0,0124 0,0126 -1,6

15 0,0121 0,0113 +7,1

20 0,0116 0,0110 +5,4

25 0,0114 0,0124 - 8,1

30 0,0109 0,0123 - 11,4

40 0,0100 0,0118 - 15,3

50 0,0097 0,0115 -15,7

60 0,0091 0,0109 - 16,5

90 0,0077 0,0104 - 25,9

Cromatogramas obtidos para as alíquotas provenientes da degradação de paracetamol
usando eletrodo de DSA-Cl2®, em diversos tempos da eletrólise.
6
1,5x10
telet = 0
telet = 10 min
telet = 30 min
telet = 50 min
telet = 90 min

6
1,0x10
Area / u.a.

5
5,0x10
Produto da
degradação

0,0

11 12 13 14 15
Tempo / min
 FINALIZANDO...........

 Mecanismos y química de la catálisis enzimática será bien

conocido, para desenvolver sensores biomiméticos.

 Podrá ser comprobado el caráter biomimético a través de

experimentos electroquímicos e informaciones del
mecanismo catalítico de la enzima modelo.

 Demostrando ser herramientas de análisis

ambientalmente amigables y alternativas a los métodos
oficiales de análisis como los cromatográficos y
espectrofotométricos, principalmente en ambientes
inhóspitos a las enzimas.
 SIN EMBARGO...............

 LÍMITES DE DETECCIÓN SIMILARES A LA DE LOS

BIOSENSORES SERÁN ALCANZADOS.

 UNA NUEVA ALTERNATIVA SON LOS POLÍMEROS

BIOMIMÉTICOS O MIPS, QUE IMITAN LAS
INTERACCIONES ANTICUERPO/ANTÍGENO.
Muchas gracias por su
atención