AMPLIFICACI

ÓN DEL ADN -
PCR
 PCR

Es un proceso de clonación in vitro que permite

obtener múltiples copias de un fragmento de un ácido
nucleico mediado por un enzima (ADN polimerasa) y a
partir de unas secuencias de iniciación de síntesis
(iniciadores, cebadores o primers), en presencia de
deoxinucleótidos de las 4 bases e iones Mg+, entre
otros componentes y sometido a ciclos repetidos de:

DESNATURALIZACION
APAREAMIENTO DE INICIADORES
EXTENSION O SINTESIS
 PCR

En la reacción, si usamos como sustrato ADN

genómico, entonces típicamente hablamos de una
PCR.
Pero si usamos ARNm, se le conoce como RT-PCR
(Reverse Transcription-PCR, por sus siglas en inglés)
En la RT-PCR la reacción se conoce como
Transcripcion reversa, y controlada por la enzima
transcriptasa reversa, capaz de convertir el ARNm
en una molécula de ADNc.
El ADNc se utiliza cuando analizamos la expresión
del ARNm de algún gen de interés.
 PARAMETROS

• Àcido nucleico diana o molde: puede tener

desde 50 a 2,000 nucleótidos de longitud.
• Polimerasa
• dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP.
• Temperatura
• Primers: secuencias cortas de nucleótidos 20-
24 nucleótidos de longitud, complementarias a
una región del DNA que se quiere amplificar.
 ELECCIÓN DE LOS PRIMERS

• Contenido de G-C ≈ 50%

• No largas secuencias de una sola base
• Evitar complementariedad, en cada uno de
los primers o entre ambos primers.
• Tamaño recomendad 20-30 pb
• Concentración 0,1 a 0,5 µM.
• Evitar G y C en el extremo 3’.
 PCR MÙLTIPLE

A la muestra extraída se le añaden varios

juegos de cebadores (cada par específico de
un microorganismo o región concreta). Al
realizar la reacción, se amplifican
diferentes dianas. Por ejemplo puede
realizarse para hacer una identificación y
detección de varios determinantes de
resistencia a los antimicrobianos.
 PCR CUANTITATIVA

Se utiliza para determinar el número de

copias de la muestra inicial. Suele
utilizarse una técnica competitiva, para
ello se incorpora a la reacción un ARN o un
ADN competidor - según el tipo de ácido
nucleico diana a amplificar-, que tenga la
misma longitud y utilice los mismos
cebadores que el ADN ó ARN problema. La
cantidad incorporada del competidor debe
ser conocida, de forma que al final de la
reacción puedan determinarse las
 PCR TIEMPO REAL

Se realiza en muy poco tiempo

(aproximadamente 30 minutos) y
proporciona una cuantificación continua y
precisa del ADN que se va formando.
 APLICACIONES

• Detección de agentes infecciosos

como: hepatitis B y C, papiloma virus,
HIV, entre otros.
• Análisis de DNA de cualquier
organismo vivo o muerto, análisis de
fósiles.
• Mutagénesis dirigida (cambios en la
información contenida a través de
“primers” con mutaciones)
• Investigación forense.