Seminário - Cultura Edu Line Heldio Kercy

HOSPITAL DO AMOR
RESIDÊNCIA MULTIPROFISSIONAL- ATENÇÃO AO CÂNCER
CULTIVO CELULAR
Aline Silva
Eduardo Cabral
Helder Freitas
Kercy Sena
Barretos - 2018
CULTIVO CELULAR Sumário
 Histórico do Cultivo Celular  Criopreservação
 Tipos de Cultura  Controle de Qualidade
 Formas de Cultivo  Diluição de Fármacos
 Características das Células  Ensaio de MTS
 Meio de Cultura  Ensaio de Migração
 Suplementos  Ensaio de Formação de Colônias
 Parâmetros Físico-Químicos  Extração de DNA e RNA
 Estrutura da Sala de Cultivo  Plaqueamento e Tratamento de Células para Apoptose
 Banco de Células  Citometria de Fluxo
 Manutenção Celular  Aplicações do Cultivo Celular

CULTIVO CELULAR Histórico
George Gey
Alexis Carrel
Ross G. Harrison (células cardíacas de embrião de galinha)
Harrison
(fibras nervosas / tubo medular)
Wihelm Roux / Joly
(placa neural de embriões de galinha)
Cultivo de tecidos
fragmentados
Alexis Carrel
CULTIVO CELULAR Tipos de Culturas
Desvantagens
Proliferação  Reduzida adesão célula-célula e célula-matriz;
in vivo  Heterogeneidade e arquitetura tridimensional;
 Espalhamento, migração e proliferação de
células não especializadas.
Proliferação
in vitro
Vantagens
 Controle do ambiente;
 Homogeneidade da amostra;
 Economia;
 Substituição dos animais em projetos de pesquisa.
CULTURA CULTURA CULTURA

PRIMÁRIA ESTABELECIDA TRANSFORMADA

 Fragmento de tecido/órgão por desagregação mecânica ou enzimática;

 Mantém as características fenotípicas e genotípicas do tecido de origem;
 Tempo de vida limitado.

 Derivam da cultura das células primárias;

 Passam por seleção, onde as células com maior capacidade proliferativa
sobrevivem;
 Elas perdem algumas características do tecido original;
 Tempo de vida mais longo em relação às células primárias.

 Características morfológicas e genéticas diferentes do tecido original;

 Genoma alterado por meio de substâncias químicas, vírus ou agentes
físicos, obtidas diretamente de tecidos mutados;
 Tempo de vida ilimitado.
CULTIVO CELULAR Formas de Culturas
ADERENTE
Oriundas de tecidos sólidos;

Dependentes de ancoragem;
Garrafas com cargas negativas;
Células epiteliais.
NÃO ADERENTE
Cultivadas em suspensão no meio;

Tecidos que não necessitam de ancoragem;
Células hematopoiéticas, linhagens transformadas,
células tumorais.
Fonte: Setor de Cultura de Células do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS), Fiocruz.
CULTIVO CELULAR Características das Células
ORGANISMO
ÓRGÃO TECIDO
NUTRIÇÃO
CULTIVO CELULAR Meios de Cultura
FLUIDOS SOLUÇÕES
BIOLÓGICOS SALINAS
EXTRATOS MEIOS
DE TECIDOS BASAIS
MEIOS
COÁGULOS
COMPLEXOS Harry Eagle
Meios Naturais Meios Artificiais

 Componentes Básicos: GLICOSE, GALACTOSE,
FRUTOSE, MALTOSE
VERMELHO DE FENOL
ÁGUA
INDICADOR DE
CARBOIDRATOS
pH
ESTIMULAM A PROLIFERAÇÃO
CELULAR, MIGRAÇÃO, CÁLCIO, SÓDIO E POTÁSSIO
DIFERENCIAÇÃO E APOPTOSE
FATOR DE
CRESCIMENTO CÉLULAS SAIS
GLUTAMINA, SERINA, METIONINA,

PROTEÍNAS AMINOÁCIDOS CISTEÍNA E TIROSINA
ALBUMINA,TRANSFERRINA
VITAMINAS
FIBRONECTINA
COFATORES DE
DIFERENTES ENZIMAS
CULTIVO CELULAR Suplementos
Soro Fetal Bovino (SFB): fração líquida do sangue coagulado do feto bovino, sem
células, fibrina e fatores de coagulação, contendo uma grande quantidade de fatores
nutricionais e macromoleculares essenciais para o crescimento celular.
Estimula o transporte de glicose, fosfato e aminoácidos e aumenta
a permeabilidade das membranas
Complexo de proteínas úteis para a nutrição, para a adesão celular

e para a proteção biológica;
Soro de origem bovina e equina;
Soro Fetal Bovino → mais efetivos para a multiplicação celular de

várias linhagens;
Meios de cultivo suplementados com 5% a 20% de soro fetal

bovino;
Testes bioquímicos e microbiológicos realizados.

CULTIVO CELULAR Suplementos
ANTIBIÓTICO
 Não são necessários para o crescimento celular,

mas podem ser utilizados para controlar o
crescimento de contaminantes como bactérias e
fungos.
Pode mascarar a contaminação por Mycoplasma e

bactérias.
Mais usados: gentamicina, a estreptomicina, a
penicilina e a anfotericina.
 SISTEMAS DE TAMPONAMENTO
TAMPONAMENTO
NATURAL (CO2)
CONTROLE pH
HEPES
VERMELHO FENOL
CULTIVO CELULAR Parâmetros físico-químicos
TEMPERATURA pH
37 °C 7,0 – 7,6
OXIGENAÇÃO OSMOLARIDADE
21 % 310 +/- 5 mOsm/kg

CULTIVO CELULAR Meios Conhecidos
Meio de Cultura Características

Meio Mínimo Essencial de EAGLE Considerado uma solução nutritiva padrão em cultura de células, por
(MEM) possuir os nutrientes básicos para a manutenção de células humanas e
de outros animais. Pode ser fornecido com aminoácidos essenciais ou
ainda variando qualquer outro componente.
Meio Basal de EAGLE Originalmente desenhado para fibroblastos de ratos e células da
(BME) linhagem HeLa, mas atualmente indicado para inúmeros tipos de
células. É um precursor do MEM e apresenta essencialmente
aminoácidos essenciais.
Roswell Park Memorial Institute Medium (Rpmi Indicado para o cultivo de hibridomas e linhas celulares leucêmicas. Não
1640) possui timidina em sua composição, sendo muito utilizado para obter a
sincronização da divisão celular.
Meio MEM modificado por Dulbecco (DMEM) Usado em muitos tipos de células de mamíferos. A versão com elevado
teor de glicose é adequada para culturas em suspensão de densidade
elevada, enquanto a fórmula com baixo teor de glicose é usada para
células aderentes.
Meio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) Indicado para células de crescimento rápido. Possui HEPES em sua
composição para um melhor tamponamento.
CULTIVO CELULAR Meios Conhecidos
Meio de Cultura Características
Meio de Glasgow (GMEM) Possui uma concentração duas vezes maior de aminoácidos, vitaminas e
glicose do que o meio BME.
Liebovitz (L-15) Desenvolvido para células tumorais de crescimento rápido. O meio
isento de bicarbonato é tamponado com níveis elevados de
aminoácidos. Utilizado no crescimento de fibroblastos em ausência de
atmosfera de CO2 e na cultura de vírus.
Meio Ham Ham F10: usado em linhagens de células diploides humanas e para
análise cromossômica. Indica-se a suplementação com proteínas e
hormônios.
Ham F12: apresenta uma composição mais complexa possibilitando o
crescimento de linhas celulares sem suplementos proteicos. Utilizado
em hepatócitos primários e células epiteliais de próstata de rato.
Meio de McCoy Desenvolvido para a cultura de linfócitos humanos. O meio 5ª de McCoy
(modificado) inclui L-glutamina e 25mM de tampão HEPES.
Meio 199 Pobre em ácido fólico, sendo muito usado para o cultivo de células não
diferenciadas e o estudo de cromossomopatias. Por ser um meio
extremamente complexo (com 61 componentes), suporta um
crescimento celular sem a adição de soro.
CULTIVO CELULAR Meios e Suplementos
 Meios para células primárias comuns
MATER METHODS pt 2013;3:175

(DOI//dx.doi.org/10.13070/mm.pt.3.175)
CULTIVO CELULAR Meios e Suplementos
 Meios para linhagens celulares
MATER METHODS pt 2013;3:175

(DOI//dx.doi.org/10.13070/mm.pt.3.175)
CULTIVO CELULAR Biossegurança
 Qual é o meu objeto de estudo?

 Quais possíveis riscos?
 Qual estrutura é necessária?
 Como devo me proteger?

NB1 NB2 NB3 NB4
 Crescentes no maior grau de contenção e complexidade do nível de proteção
POTENCIAL PATOGÊNICO DESCONHECIDO:

análise detalhada e criteriosa de todas as
condições experimentais!
Resolução – RDC nº 50, de 21 de fevereiro de 2002. Regulamento Técnico para planejamento, programação,
elaboração e avaliação de projetos físicos de estabelecimentos assistenciais de saúde.
RDC Nº 222, DE 28 DE MARÇO DE 2018. Regulamenta as Boas Práticas de Gerenciamento dos Resíduos de
Serviços de Saúde e dá outras providências.
NÍVEL DE BIOSSEGURANÇA 1
Manipulação de agentes da classe de risco 1, ou seja,
microrganismos que têm baixa probabilidade de
provocar doenças em homens ou animais.
ESPECIFICAÇÕES
Não são necessários equipamentos
específicos de proteção (barreiras primárias) e
quanto às instalações (barreiras secundárias)
são exigidas apenas bancadas abertas com
pias próximas.
 Lavagem de mãos;
 Não comer, beber e fumar.
 Evitar o uso de calçados abertos;
 Utilizar dispositivos mecânicos para a pipetagem, sendo proibido
fazê-lo pela boca;
 Não usar acessórios como anéis, relógios e pulseiras durante as
atividades laboratoriais;
 Possuir kit de primeiros socorros;
 Realizar a desinfecção das superfícies de trabalho ao final do uso
ou quando houver contato direto de material viável;
 Possuir programa de controle de insetos e roedores.
Manipulação de microrganismos que podem causar
infecção, mas que são de tratamento fácil e eficaz-
representando risco individual moderado e baixo para a
comunidade.
ESPECIFICAÇÕES
Uso de equipamentos de segurança, como luvas,
aventais e proteção para o rosto quando necessário.
Quando a manipulação de agentes provocar aerossóis
ou vazamentos de materiais infecciosos, é determinado
o uso de Cabines de classe I ou II.
Instalações: NB 1 + Autoclave
 Possuir acesso limitado;

 Dispor de aviso de Risco Biológico;
 Possuir precauções para objetos perfuro cortantes;
 Apresentar Manual de Biossegurança que defina qualquer
descontaminação de dejetos ou normas de vigilância médica.
Destinado ao trabalho com agentes de risco biológico
de classe 3, potencialmente fatais, que apresentam
elevado risco individual e baixo risco para a
comunidade.
ESPECIFICAÇÕES
Equipamentos NB 2 + Cabines de classe I ou II
em todas as manipulações de agentes
abertas.
 Apresentar acesso rigorosamente controlado;

 Realizar desinfecção de todo o lixo, assim como a roupa usada no
laboratório antes de ser lavada;
 Coletar e armazenar amostra sorológica de cada colaborador exposto
ao risco como referência;
 A instalações seguem o NB 2 somadas a separação física dos
corredores de acesso, portas duplas com fechamento automático, ar
de exaustão que não deve recircular e o fluxo negativo dentro do
laboratório.
Exposição à agentes altamente patogênicos, de fácil
propagação, que não possuem medidas terapêuticas ou
profiláticas, representando um elevado risco individual e
para a comunidade.
ESPECIFICAÇÕES
Todos os procedimentos devem ser realizados dentro de
Cabine classe III ou em Cabines de classe I ou II,
juntamente ao uso do macacão de pressão positiva com
suprimento de ar.
 Seguir as recomendações do NB 3, sendo que o edifício ou a área do

laboratório devem ser isolados, os sistemas de abastecimento e
escape à vácuo, eficiente sistema de descontaminação.
 Mudança de roupa antes de entrar;
 Banho ao sair;
 Descontaminação de todo o material na saída do laboratório.
CULTIVO CELULAR Boas práticas
Prática
Atenção
Treinamento
CULTIVO CELULAR Cultivo de Célula Animal
Infraestrutura Descartáveis Soluções e

Reagentes
 Paredes abauladas  Meio de cultura
 Material de revestimento  EPI’s
 Pipetas e ponteiras  PBS
lavável  FBS
 Fluxo de ar controlado  Garrafas
 Frascos de criopreservação  Água estéril
 Manutenção dos filtros  Reagentes (DMSO,
HEPA’s  Filtros (0,22 µm)
 Seringas Álcool 70%)
 Fluxo de matérias e
pessoas  Falcon (15 e 50 mL)
 Descarte para materiais
biológicos
 Equipamentos
CULTIVO CELULAR Estrutura
Área suja
Área limpa Saída
Ante-sala Recepção de material

Entrada
CULTIVO CELULAR Cultivo de Célula Animal
 EPI’s
Luvas Avental Touca Propé Máscara

CULTIVO CELULAR Equipamentos para Cultivo
CULTIVO CELULAR Materiais para Cultivo
CULTIVO CELULAR Banco de células “Megastores”
CULTIVO CELULAR Banco de células “Megastores”
CULTIVO CELULAR Manutenção das Células
 Expansão das células
OU
 Confluência (quantidade de células %)

 Deadesão celular (mecânica ou enzimática)
Fonte:http://4.bp.blogspot.com/-
su56oP7ZeKY/ToiiTsDi5PI/AAAAAAAAAAQ/gO3q6tVDgLM/s1600/Sem+t%25C3%25ADtulo.png
 Quantificação celular
Quantificação celular direta

CULTIVO CELULAR Criopreservação
Crioprotetores: são substâncias usadas para

proteger o tecido biológico dos danos do
congelamento (dano esse devido à formação
de gelo).
 Glicerol
 Propilenoglicol
 DMSO (5-20%)
 Soro
CULTIVO CELULAR Criopreservação
 Congelamento lento  Descongelamento rápido
Fonte: MANUTENÇÃO de linhagens de células animais. In: FUNDA«ÃO

OSWALDO CRUZ. Manual da qualidade. Rio de Janeiro: INCQS/Fiocruz, 2008
Fonte: http://www.crh.com.br/allimg/galeria/fig9_1.gif
CULTIVO CELULAR Controle de Qualidade
 Histórico da célula
 Características
 Comportamento do metabolismo
 Meios de cultura utilizados
 Teste de contaminação
 Testes de compatibilidade
CULTIVO CELULAR Controle de qualidade
 CONTAMINAÇÃO
Coloração Bactérias
Odor
Turbidez
Morfologia
Metabolismo
Fungos
 CONTAMINAÇÃO POR MICOPLASMA: PCR
Bioluminescência (lise de micoplasma)
 Não altera necessariamente a morfologia ou a Fluorescência (DAPI)
cinética de multiplicação celular; Microscopia de Varredura Eletrônica (MEV)
 Taxa de crescimento alterada, alterações
morfológicas, aberrações cromossômicas,
alterações no metabolismo de aminoácidos e
ácidos nucleicos.
Tratamento para micoplasma

Fonte: http://bcrj.org.br/servicos/analises-de-microplasma/
 CARIÓTIPO  ANÁLISE DE ISOENZIMAS
https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRftIdeirZ8xZ_tQHYNkF5MaiUycTiDf4LwmIWjnQ9w8lIxnKGB
http://3.bp.blogspot.com/-ZhvE4-Z8db8/Tkn5k0wsKuI/AAAAAAAACgc/6qjxacTe-1k/s640/chromosomenormalXtumor.jpg
 DNA Fingerprinting  STR
http://www.nemumpoucoepico.com/wp-content/uploads/2013/04/SNP_STR.jpg
CULTIVO CELULAR Natureza do ensaio
 A escolha do ensaio dependerá do agente em estudo, da natureza da resposta

e da célula alvo em particular.
VIABILIDADE METABOLISMO FUNCIONAIS
CITOTOXICIDADE PROLIFERAÇÃO
Freshney, R. Ian. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications, 6th ed.
CULTIVO CELULAR
Ensaios de viabilidade celular

CULTIVO CELULAR Viabilidade celular
 Determinar a proporção de células viáveis após um procedimento

potencialmente traumático, como a desagregação primária,
criopreservação ou citotoxicidade de uma droga;
 Há uma variedade de métodos de ensaios que podem ser usados para

estimar o número de células viáveis;
 Observar o efeito do agente causador da injúria em diferentes espaços de

tempo.
Diluição de fármacos e citotoxicidade
 Citotoxicidade é a capacidade intrínseca de um composto promover
alteração metabólica nas células em cultura, podendo culminar ou não em
morte celular;
 IC50 → medida quantitativa que indica quanto de um determinado
fármaco ou outra substância ( inibidor ) é necessário para inibir um dado
processo biológico pela metade. Os valores são tipicamente expressos
como concentração molar ;
 Curva de diluição.
 Regra de diluição de DMSO a 1% por poço;
 A droga a ser testada para o ensaio de citotoxicidade deve ser diluída em

DMSO, para isso faz-se os cálculos da curva de diluição respeitando sempre
a regra de 1% de DMSO.
..........
Criando os pontos da curva Solução de trabalho [ ] Cálculo da solução de

100x estoque 10mM
0,2 µM 20 µM Cálculo da molaridade (M)
0,5 µM 50 µM
M(g)/mm.v(L)
0,8 µM 80 µM
X (g) / 1mL DMSO
Cálculo do
C1.V1=C2.V2
subestoque
Proporção de 1:100
 Após a cultura ser tratada com a droga e encubada, o próximo passo será
começar os ensaios de acordo com o que o pesquisador deseja responder;
 Os ensaios baseiam-se na medição de uma atividade marcadora associada

ao número de células viáveis;
RISS, R T., et al. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. 2016
 Redução de tetrazólio, redução de resazurina, marcadores de protease e

detecção de ATP;
 Incubação de um reagente com uma população de células viáveis para

converter um substrato num produto colorido ou fluorescente que pode
ser detectado com um leitor de placas.
 Ensaios de redução de Tetrazólio: MTS, MTT, XTT, WST‐8
Ensaio de MTT
 Sal de coloração amarela;

 Reduzido na mitocôndria das células vivas, clivagem da enzima succinato
desidrogenase em cristais de formazan de coloração púrpura;
 Os cristais de formazan acumulam-se como um precipitado dentro das
células, devido a isso, ele deve ser solubilizado antes da leitura em DMSO;
 Cristais formados = Células viáveis
 A densidade óptica (OD) resultante do Teste MTT é determinada em
espectrofotômetro.
..........
Ensaio de MTT
espectrofotômetro.
..........
Ensaio de MTT

espectrofotômetro.
..........
Ensaio de MTT

espectrofotômetro.
..........
Ensaio de MTT

espectrofotômetro.
..........
Ensaio de MTT
MTT
Ensaio de MTT
Citotoxicidade de flavonóides contra células Vero.

ZANDI et al., Antiviral activity of four types of bioflavonoid against dengue virus type-2. Virology journal. 2011.
Ensaio de MTS
 Os reagentes de tetrazólio mais recentemente desenvolvidos podem ser

reduzidos por células viáveis para gerar produtos formazano que são
diretamente solúveis no meio de cultura celular;
 Esse melhoramento fez com não fosse mais necessário a adição de DMSO
na placa para solubilizar os precipitados de formazano.
..........
Ensaio de MTS
 A diferença entre o teste de MTS e MTT está na estrutura dos corantes vitais;
▪ MTT, necessidade de utilizar o corante DMSO ou Isopropanol para
dissolver os cristais de formazan.
▪ MTS, os cristais formados são solúveis em água.
MENEZES, M. S. Papel do jaspamídeo na dinâmica do citoesqueleto de actina das células de melanoma : relação com migração e invasão. 2011.
CULTIVO CELULAR
Ensaios de Proliferação Celular

CULTIVO CELULAR Proliferação celular
Cicatrização de ferida (Wound healing)
 A motilidade é uma característica essencial das células vivas;
 O estudo da migração celular na pesquisa do câncer é de particular

interesse, pois a principal causa de morte em pacientes com câncer está
relacionada à progressão metastática;
 Os ensaios de fechamento de ferida de cultura de células e de migração e

invasão de células transwell são amplamente utilizados;
Claire M. Wells and Maddy Parsons (eds.), Cell Migration: Developmental Methods and Protocols,
 Analisar a capacidade de células únicas responderem direcionalmente a vários

quimiotáticos;
 Pode também avaliar a capacidade migratória diferencial devido à
superexpressão de um receptor;
 Teste simples e acessível.
..........
DMEM A 0,5% Confluência a ?
0h, 24h, 48h, 72h

..........
Ensaio de fechamento de ferida de célula de melanoma B16F10.
Ensaio de formação de colônia
 Ensaio de sobrevivência celular in vitro baseado na capacidade de uma
única célula se transformar em uma colônia;
 É utilizado para determinar a morte reprodutiva celular após o tratamento
(radiação, drogas).
 Uma célula que retém sua capacidade de sintetizar proteínas e DNA e
passar por uma ou duas mitoses, mas é incapaz de se dividir e produzir um
grande número de progênies, é considerada morta.
BOROWICZ, S. et al., The soft agar colony formation assay. J Vis Exp. 2014.
..........
..........

Ensaio de formação de colônia independente de ancoragem
 Células epiteliais, endoteliais e fibroblastos podem ser induzidos a

apoptose (anoikis) quando se destacam da matriz extracelular;
 Células transformadas têm a capacidade de crescer e se dividir sem se

ligar a um substrato.
..........
 O crescimento independente de ancoragem é a capacidade de células

transformadas crescerem independentemente de uma superfície sólida;
 Avaliar o potencial clonogênico;
 Inferir o potencial tumorigênico.
..........
 Ágar base é mais concentrado e fica em contado direto com o fundo da

placa, ágar + meio DMEM;
Impedir a aderência das células
 As células são cultivadas em uma camada de ágar (de baixa

concentração) + meio DMEM (ágar top);
 A concentração final de células por poço deve ser observada.

Contagem das colônias
 Microscópio
 Imagem digital e contagem usando um software
 ImageJ
..........
Ensaio de formação de colônia dependente de ancoragem
 Todas as células derivadas de tecidos (exceto hematopoiético) são

células dependentes de ancoragem e necessitam de um suporte de
cultura de superfície para proliferação normal;
 O ensaio dependente de ancoragem demonstra a capacidade da célula,

que foi exposta a um agente agressor, de formar colônias.
..........
Ensaio de formação de colônia dependente de ancoragem
Contagem das colônias

 Microscópio
 Imagem digital e contagem usando um software
 ImageJ
..........
CULTIVO CELULAR Aplicações
INTERAÇÃO CÉLULA-CÉLULA:
Morfogênese, controle parácrino,
proliferação celular, cinética,
cooperação metabólica, adesão e
motilidade celular, interação
matricial, invasão. ATIVIDADE INTRACELULAR:
ENGENHARIA DE TECIDOS:
Transcrição de DNA, síntese de
Construções de tecidos, matrizes e
proteínas, metabolismo energético,
suportes, fontes de células-tronco,
metabolismo de drogas, ciclo celular,
propagação, diferenciação
diferenciação, apoptose.
Cultivo de
Células FLUXO INTRACELULAR:
FARMACOLOGIA: Ação de droga,
Processamento de RNA, receptores
interações de ligante receptor,
de hormônios, fluxo de metabólitos,
metabolismo de droga, resistência
mobilização de cálcio, transdução de
de droga. TOXICOLOGIA.
sinal, tráfego de membrana.
GENÔMICA: Análise genética,

PROTEÔMICA: produtos genéticos, transfecção, infecção,
fenótipo celular, vias metabólicas transformação, imortalização,
senescência.
DESENHO EXPERIMENTAL – DROGAS
Dia: 0 3
qPCR
DROGAS
Expressão gênica
Citometria de Fluxo
Viabilidade; imunofenotipagem
CULTIVO CELULAR Extração de DNA/RNA
Maior parte dos protocolos de extração de DNA/RNA consiste em duas partes:
1. Lise das células e solubilização do DNA.
1. Métodos enzimáticos e/ou químicos para remover proteínas contaminantes, RNA

ou macromoléculas.
Métodos simples e as amostras podem ser estocadas por vários meses.
Métodos de extração:
 Fenol/Clorofórmio;
 Resinas;
 Kits comerciais.
O Trizol é constituído de uma solução monofásica de fenol e isotiocianato de

guanidina que rompe a célula e dissolve os componentes celulares mantendo
a integridade do RNA total.
CULTIVO CELULAR Protocolo RNA
1. Descongelar e adicionar clorofórmio 3. Transferir a fase aquosa

4. Adicionar álcool 6. Deixar secar a TA
isopropílico (ppt RNA)
Fase Aquosa**
Proteínas, DNA
Fase Orgânica - 80C 1
hora
5. centrifugar a
2. centrifugar a
15.000 rpm por 15’
15.000 rpm por 15’ a
a 4C e lavar com
4C etanol
**Fenol: pH 5 – 6  RNA na fase aquosa

pH 7 – 8  DNA na fase aquosa
Extração RNA total

Quantificação em
espectofotômetro
7. Diluição em
água DEPC (100 x)
•Leitura em 260nm Abs x Diluição x 40* = µg/mL
•Grau de pureza Razão 260nm/280nm = 1,6 < x < 2,0
Razão 260nm/230nm = 1,8 < x < 2,0
*Para RNA: 1 DO = 40
Amostras
1 2 3
28s
18s
5s
DESENHO EXPERIMENTAL – DROGAS
Dia: 0 3
qPCR
DROGAS
Expressão gênica
Citometria de Fluxo
Viabilidade; imunofenotipagem
CULTIVO CELULAR Citometria de Fluxo
COMPONENTES DE UM CITÔMETRO Eletrônicos
Fluidico
Óptico
(detectores)
Óptico
(lasers)
SISTEMA DE FLUIDOS
 Vital para que as células passem pelo feixe de laser em
suspensão única;
 Células injetadas em um fluxo de solução salina (fluido da
bainha);
 Focalização hidrodinâmica;
 Comprime o fluxo de células para aproximadamente 1 célula
de diâmetro;
 A ótima "imagem" das células é obtida com uma taxa de
fluxo "baixa" e alta concentração de amostra.
O que é citometria de fluxo?
Análise de partículas individuais, muitas vezes células, dentro de uma suspensão
heterogênea.
FLUIDOS Células em suspensão 

Fluxo em fila única 
Iluminadas e emitem fluorescencia 
ÓPTICO
Coletada e filtrada 
Convertida para valores digitais 
ELETRÔNICO
Guardados em um computador 
Eletrônico
SISTEMA ELETRÔNICO
Voltagem
Laser
Tempo
Voltagem
Laser
Tempo
Voltagem
Laser h
Tempo
Tamanho e granularidade usando citometria de fluxo
Side scatter
Forward
scatter
Fluidics
Detectores
FLUORESCÊNCIA
A intensidade de fluorescência emitida é proporcional aos locais de ligação
FITC FITC
FITC
FITC
FITC
FITC FITC
Número de eventos
FITC
FITC
FITC
Log scale da intensidade de fluorescência

Aplicações de citometria de fluxo em pesquisa
 Análise “multicolorida”
 Ciclo de celular
 Proliferação
 Apoptose e Viabilidade Celular
 Classificação de Células
 Análise multiplex
GATES
Aplicação de Gates para análise de subpopulação
Estratégias simples de gating…
Sangue total Populações dentro dos linfócitos

Gate em linfócitos
E complexas…
IMUNOFENOTIPAGEM – Diagnóstico / Estadiamento de Leucemias
Populações Identificadas
CD4+/CDw29+ Helper/effector, more mature memory
CD4+/CD45R+ Suppressor inducer, less mature
CD4+/Leu8+ Suppressor inducer, some helper
CD4+/Class II MHC Activated cells, immature cells
CD4+/CD25+ Activated cells (IL2 receptor)
CD4+CD38+ Immature cells, activated cells
CD8+/CD11b+ Of the CD11b+ cells the suppressors
CD8+ CD8+/CD28+ Cytotoxic precursor/effector cells
CD8+/CD57+ Cytotoxic function
CD8+/Class II MHC+ Activated cells, immature cells
CD8+/CD25+ Activated cells (IL2 receptor)
CD8+/CD38+ Immature cells, activated cells
CD16+/CD57+ Low NK activity
CD16+/CD56+ Most potent NK activity
PROLIFERAÇÃO
CFSE
APOPTOSE
A apoptose resulta em vários eventos celulares que podem ser analisados por FACS:
Fragmentação de DNA (corante Hoechst)
Estrutura da membrana e integridade Annexin-V, PI)
Função mitocondrial (Mitotracker Red)
Atividade de caspase (ensaio de anticorpos)
VIABILIDADE
Detecção de apoptose usando captação de corante de viabilidade
Mudanças na permeabilidade da membrana devido

à apoptose permitem que corantes intracelulares
corram células não-fixadas
7-AAD (DNA)
Células vivas excluem corante
Células apoptóticas mancham 7-AAD
Células mortas mancham 7-AAD

VIABILIDADE
Ensaio de anexina-V / PI para apoptose:
Fosfatidilserina normalmente no interior da membrana celular.
AnnV-FITC
fosfatidilserina
FITC
PI
VIABILIDADE
Ensaio de anexina-V / PI para apoptose:
Fosfatidilserina normalmente no interior da membrana celular.
AnnV-FITC
fosfatidilserina
PI
SORTING
 Permite que populações raras sejam
isoladas de populações heterogêneas
(cultura celular, amostras de sangue, etc)
 Pode isolar partículas sub-celulares (por
exemplo, endossomos, núcleo,
cromossomos)
 Permite que experimentos de transfecção
sejam enriquecidos e que clones de
células únicas sejam isolados
 Pode produzir pureza> 95%
ENSAIOS FUNCIONAIS
 Drogas
 siRNAs Ensaios Bioquímicos
 microRNAs
 Vetores de Expressão Sinais de Repórteres
 ETC...
Contagem Celular
Análises Morfológicas
Fenotipagem
Xia e Wong 2012

ENSAIOS FUNCIONAIS
Células em placas com múltiplos poços, tratadas com um gene ou perturbante químico.
Medidas
Microscopia
Automatizada (size, shape, intensity,
texture, etc.)
Exploração de dados &

machine learning
REFERÊNCIAS
Resolução – RDC nº 50, de 21 de fevereiro de 2002. Regulamento Técnico para
planejamento, programação, elaboração e avaliação de projetos físicos de
estabelecimentos assistenciais de saúde.
RDC Nº 222, DE 28 DE MARÇO DE 2018. Regulamenta as Boas Práticas de
Gerenciamento dos Resíduos de Serviços de Saúde e dá outras providências.
Freshney RI. Basic principles of cell culture. Hoboken: John Wiley and Sons; 2006
MANUTENÇÃO de linhagens de células animais. In: FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ.
Manual da qualidade. Rio de Janeiro: INCQS/Fiocruz, 2008
REFERÊNCIAS
ZANDI et al., Antiviral activity of four types of bioflavonoid against dengue virus type-2. Virology journal.
2011.
MENEZES, M. S. Papel do jaspamídeo na dinâmica do citoesqueleto de actina das células de
melanoma : relação com migração e invasão. 2011.

Seminário - Cultura Edu Line Heldio Kercy

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HOSPITAL DO AMOR

RESIDÊNCIA MULTIPROFISSIONAL- ATENÇÃO AO CÂNCER

 Tipos de Cultura  Controle de Qualidade

 Formas de Cultivo  Diluição de Fármacos

 Características das Células  Ensaio de MTS

 Meio de Cultura  Ensaio de Migração

 Suplementos  Ensaio de Formação de Colônias

 Parâmetros Físico-Químicos  Extração de DNA e RNA

 Estrutura da Sala de Cultivo  Plaqueamento e Tratamento de Células para Apoptose

 Banco de Células  Citometria de Fluxo

 Manutenção Celular  Aplicações do Cultivo Celular

CULTURA CULTURA CULTURA

CULTURA CULTURA CULTURA

 Fragmento de tecido/órgão por desagregação mecânica ou enzimática;

CULTURA CULTURA CULTURA

 Derivam da cultura das células primárias;

CULTURA CULTURA CULTURA

 Características morfológicas e genéticas diferentes do tecido original;

Oriundas de tecidos sólidos;

Cultivadas em suspensão no meio;

Meios Naturais Meios Artificiais

GLUTAMINA, SERINA, METIONINA,

Complexo de proteínas úteis para a nutrição, para a adesão celular

Soro de origem bovina e equina;

Soro Fetal Bovino → mais efetivos para a multiplicação celular de

Meios de cultivo suplementados com 5% a 20% de soro fetal

Testes bioquímicos e microbiológicos realizados.

 Não são necessários para o crescimento celular,

Pode mascarar a contaminação por Mycoplasma e

21 % 310 +/- 5 mOsm/kg

Meio de Cultura Características

 Meios para células primárias comuns

MATER METHODS pt 2013;3:175

 Meios para linhagens celulares

MATER METHODS pt 2013;3:175

 Qual é o meu objeto de estudo?

 Como devo me proteger?

NB1 NB2 NB3 NB4

 Crescentes no maior grau de contenção e complexidade do nível de proteção

POTENCIAL PATOGÊNICO DESCONHECIDO:

 Possuir acesso limitado;

 Apresentar acesso rigorosamente controlado;

 Seguir as recomendações do NB 3, sendo que o edifício ou a área do

Infraestrutura Descartáveis Soluções e

Ante-sala Recepção de material

Luvas Avental Touca Propé Máscara

 Expansão das células

 Confluência (quantidade de células %)

 Deadesão celular (mecânica ou enzimática)

Quantificação celular direta

Crioprotetores: são substâncias usadas para

 Congelamento lento  Descongelamento rápido

Fonte: MANUTENÇÃO de linhagens de células animais. In: FUNDA«ÃO

Tratamento para micoplasma

 CARIÓTIPO  ANÁLISE DE ISOENZIMAS

 DNA Fingerprinting  STR

 A escolha do ensaio dependerá do agente em estudo, da natureza da resposta

VIABILIDADE METABOLISMO FUNCIONAIS

Ensaios de viabilidade celular

 Determinar a proporção de células viáveis após um procedimento

 Há uma variedade de métodos de ensaios que podem ser usados para

 Observar o efeito do agente causador da injúria em diferentes espaços de

 Regra de diluição de DMSO a 1% por poço;

 A droga a ser testada para o ensaio de citotoxicidade deve ser diluída em

 Incubação de um reagente com uma população de células viáveis para