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MÉTODOS HISTOQUIMICOS

GERMAN OSORIO
• LA FINALIDAD DE UNA COLORACIÓN es crear un contraste entre el BLANCO Y EL MEDIO
QUE LO RODEA.
PRINCIPIOS FUNDAMENTALES
Mecanismos de unión
• PROBLEMAS MÁS COMUNES EN LA TINCIÓN

1. Tinción excesiva
2. Coloración pálida.
3. Precipitados de los colorantes.

• PRINCIPALES DEFECTOS DE LAS PREPARACIONES

1. Excesiva celularidad.
2. Excesiva dilución celular.
3. Contaminación sanguínea.
4. Presión excesiva.
5. Secado defectuoso.
6. Fijación inadecuada.
7. Coloración inadecuada.
TINCION DE GRAM
Tinción de
gram

Compuesta Diferencial

Divide a las
Varios
bacterias en
reactivos
dos grupos
GRAM POSITIVO
GRAM NEGATIVO
FUNDAMENTO DE LA COLORACION DE GRAM

Se basa en la naturaleza química de la pared


celular de las bacterias.

• GRAM+ presentan una gruesa pared de peptidoglicano


mas si membrana celular.

• La gram- presentan una gruesa capa de lípidos y una


delgada capa de peptidoglicano y la membrana celular
presenta proteínas llamadas porinas entre la capa
lipídica
Reactivos Colorantes
• Cristal violeta • Cristal violeta
• Lugol o yodo • Safranina
• Alcohol cetona
• Safranina
• Secciones de parafina CONSIDERACIONES

ANATOMIA PATOLOGICA
• Use rojo neutro en lugar de safranina; organismos gram negativos
generalmente se tiñen mal debido a que su lípido bacteriano de la pared se
elimina en el procesamiento de tejidos
• Nota: con la tinción de hematoxilina y eosina en las secciones de parafina,
las bacterias aparecen como barras azules o cocos independientemente de la
reacción del gramo; las colonias aparecen como grupos azules difusos

MICROBIOLOGIA
• La estrategia de diagnóstico rápido para muestras de lavado
bronquioalveolar consiste en la tinción de Gram y el ensayo bacteriano ATP
( Arch Pathol Lab Med 2005; 129: 78 )
• No es adecuado para superficies con quemaduras ( Arch Pathol Lab Med
2003; 127: 1485 )
BACTERIAS
METODO OBJETIVO
GRAM MAYORIA DE LAS
BACTERIAS
BAAR MICOBACTERIAS,
NOCARDIA
TINCIONES DE PLATA HONGOS Y AMEBAS
MUCICARMIN CRIPTOCOCOS
GIEMSA CAMPYLOBACTER,
LEISHMANIASIS,
TRYPANOSOMA,
PLASMODIUM
La coloración de Gram

Permite clasificar las bacterias de según


• Su morfología
• Su afinidad tintorial
• Su disposicion
Una tinción de Gram en la que se observa un mezclado de
Staphylococcus aureus (coco gram positivo) y Escherichia coli (bacilo
gramnegativo).
• Bacterias grampositivas de Bacillus anthracis (bacilos morados) que
producen una enfermedad llamada carbunco, encontrados en una muestra
de líquido cerebroespinal. Si hubiera una especie de bacteria gram negativa,
aparecería de color rosa. El resto son los leucocitos que atacan la infección.
VERDE MALAQUITA
bacillus, malachite, green, spore, stain, 1000x,
magnification
ACIDO RESISTENCIA PARED CELULAR
ARABINOGALACTANO
BAAR
• Ziehl-Neelsen (clásico): método común; las bacterias se tiñen de rojo brillante debido
a la retención del colorante de carbol-fucsina; el fondo es contratinción de azul de
metileno; El procedimiento implica calor (n . ° 1 , n . ° 2 )

• Ziehl-Neelsen (blanqueador modificado) variante histologica; fuscina acida


y hematoxilina, previo uso de acido peryodico: puede ser más ( Acta Cytol
2008; 52: 325 , J Cytol 2012; 29: 165 )

• Ziehl-Neelsen (modificado para muestras de heces): no requiere calentamiento


( Centros para el Control de Enfermedades )
1. Kinyoun: método común; usa colorante de fucsina más concentrado y solvente de
lípidos, pero no calor; las bacterias se tiñen de rojo brillante contra el fondo verde (n . °
1,n.°2)
2. Fite: para detectar M. leprae (lepra) y Rhodococcus ( Diagn Cytopathol 2001; 24:
244 ); combina aceite de cacahuete / vegetal con xileno para minimizar la exposición
de la pared celular bacteriana a los solventes orgánicos y proteger la resistencia al ácido
precaria del organismo (n . ° 1 , n . °
ZIEHL NELLSEN
Mycobacterium_tuberculosis_Ziehl-Neelsen_stai
Mycobacterium avium-complex, Ziehl-Neelsen acid fast stain.
KIN YOUN
COCCIDEOS INTESTINALES
• Figura 2. Ooquistes de Isospora belli. Tinción de Kinyoun
• Tinción ácido alcohol. Chiang Mai University,
Thailand y CDC.
• Cryptosporidium sp. en células epiteliales de vesícula.
CDC/Dr. E. Ewing Jr
• Cryptosporidium sp. Ooquistes. Examen en fresco
COLORACION DE FITE FARACO
COLORACION DE FITE FARACO
Tincion de Grocott(plata melamina)

• El acido peryodico presente en la


coloración oxida los polisacáridos
• Añadir ácido peryódico
de la pared celular de los hongos 0,5 %
convirtiendolos en aldehidos • Plata metanamina
• Cloruro de oro, 1 minuto.
• Añadir tiosulfato sódico
• Estos aldehidos reducen el Tinción de contraste
complejo plata metamina (rojo nuclear,
produciendo la coloroacion de cafe hematoxilina, verde
luz...), 1 minuto.
a negra debido al deposito de plata • Deshidratar, aclarar,
sobre la pared montar.
Reticulina, membranas basales, hongos, mucinas, glucógeno: negro.
Fondo: según tinción de contraste.
Núcleos: marrón oscuro a negro
RESULTADOS
• Reticulina: negro
• Membranas basales: negras
• Hongos: negro
• Mucina: negro
• Glucogeno: negro
• Fondo: de acuerdo a la coloración de contraste
• NUCLEOS? MARRON OSCURO A NEGRO

ASPERGILOSIS, ZIGOMICOSIS, CANDIDIASIS, CRIPTOCOCOSIS


Grocott ’ s stain highlighting the Aspergillus hyphae
(H & E ϫ 200). 
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DIFF o técnica de witlin (DiffQuick)
VISUALIZACION
• INTRACELULARES:
1. MUCINAS CITOPLASMATICAS
2. DETALLES CITOPLASMATICOS
3. GOTAS DE GRASA
4. GRANULOS NEUROSECRETORES
• EXTRACELULARES
1. MUCINA LIBRE
2. COLOIDE Resultados:
Nucleos azules violaceos
Citoplasmas: azul claro rosa
Eritrocitos maduros: naranja rosado
Nucleolo: color rosa
COLOIDE
FONDO TIGROIDE
MEMBRANAS BASALES
FONDO FIBROMIXOIDE
H. Pylori (bacterias azules)
Estructura Color
Eritrocitos Rosa / rojo amarillento
Plaquetas Gránulos de violeta / púrpura
Núcleo azul, citoplasma rosado,
Neutrófilos
gránulos de violeta
Núcleo azul, citoplasma azul,
Eosinófilos
gránulos rojos
Núcleo púrpura / azul oscuro,
Basófilos
gránulos violetas
Núcleo violeta, citoplasma azul
Monocito
claro
COLORACION DE PAS
Ella evidencia la presencia de grupos aldehídos por la oxidación previa de
carbohidratos tratados posteriormente con Reactivo de Schiff
Oxidacion de tejidos para aumentar el numero de cetonas y Aldehidos
REACTIVOS Resultados
• Ácido peryódico al 5 % Glúcidos: rosa intenso o fuscia
• Reactivo de Schiff
Nucleos: azul oscuro( solo se tiñe la
• Hematoxilina de Mayer
cromatina)
COLORACION DE PAS, USOS
Citología mamaria: las células PASD positivas con estructura interna y que producen
indentación nuclear, particularmente en células disociadas o atípicas, se correlacionan con la
histología maligna (J Clin Pathol 2001; 54: 146)
Hongos: TIÑE las paredes de las células fúngicas; El gránulo PAS + en el extremo anterior de
las esporas maduras es diagnóstico de microsporidios (BMC Clin Pathol 2006; 6: 6)
Hematopatología: ALL, AML M5-M7 son PAS +
Riñón: recomendado para la evaluación de rutina de biopsias renales debido a la tinción de la
membrana basal; también es útil para diagnosticar el carcinoma de células renales (tiñe el
glucógeno, eliminado por diastasa)
Hígado: tinción de rutina para hepatocitos (PAS sin diastasa); también mancha las inclusiones
de la enfermedad alfa-1-antitripsina
Pulmón: tiñe glóbulos amorfos o granulares en líquido BRONCOALVEOLAR en proteinosis
alveolar pulmonar (J Clin Pathol 1997; 50: 981)
Biopsias musculares: tinción de rutina para demostrar glucógeno
Páncreas: carcinoma de células acinares (PASD +)
Glándulas parótidas: los gránulos de zimógeno son PAS +
• Próstata: las glándulas de Cowper son PASD + (Am J Surg Pathol 1997; 21: 550)
• Piel: los cuerpos globoides eosinofílicos (cuerpos de Kamino) en el nevo de Spitz
son PASD +
• Intestino delgado: tiñe la bacteria de la enfermedad de Whipple (Am J Clin
Pathol 2002; 118: 742, Hum Pathol 2003; 34: 589); fuerte tinción citoplásmica
presente en la enfermedad de inclusión microvillo versus tinción lineal en cepillo
en personas normales (Am J Surg Pathol 2002; 26: 902)
• Testículo: tiñe la neoplasia intratubular de células germinales (Am J Surg Pathol
1994; 18: 947) y el seminoma (PAS +, PASD negativo), pero no los túbulos
seminíferos normales
• Tumores: adenocarcinoma de varios sitios (mucina es PASD +), sarcoma de
partes blandas alveolares (PASD + estructuras cristalinas), carcinomas apocrinos,
tumores que contienen membrana basal (cylindroma [Am J Surg Pathol 2001;
25: 823], espiradenoma ecrino), tumores de células claras (manchas de
glucógeno), carcinomas ricos en glucógeno, melanoma rico en glucógeno / células
de globo (Arch Pathol Lab Med 1998; 122: 353), tumor de células granulares
(gránulos citoplásmicos), glóbulos hialinos en tumores renales (Hum Pathol
1997; 28: 400), tumores mucinosos, enfermedad de Paget de los senos
• Otro: manchas malakoplakia
• Enzima citoquímica: tinción granular gruesa
ñidas con hematoxilina y eosina (A) y con PAS y hematoxilina (B). Las secciones pertenecen a campos similares del digestivo. La tinción de fucsia corresponde al reactivo de Schiff, el cual marca muc

• Secciones de parafina de 8 µm de grosor teñidas con hematoxilina y eosina (A) y con PAS y
hematoxilina (B). Las secciones pertenecen a campos similares del digestivo. La tinción de fucsia
corresponde al reactivo de Schiff, el cual marca mucopolisacáridos de las células caliciformes.
• Esophageal candidiasis, PAS stain
A PAS stain demonstrates the abundant glycogen that is present within the
cytoplasm of the hepatocytes. The process of glycogen storage is promoted by the
hormone insulin from beta cells of pancreatic islets, while glycogenolysis with
gluconeogenesis is stimulated by glucagon release from alpha cells of the islets of
Langerhans. Bile canaliculi between the plates of hepatocytes drains toward the
triad at the left.
PAS DIASTASA (CONTROL)
PAS AZUL ALCIAN

• Sección de parafina teñida con PAS-azul alcián. Se observan mucocitos epiteliales de


color azul, lo que indica que tiene sacáridos ácidos y otros rosados que son azúcares
PAS positivos. La imagen proviene del epitelio de una oreja de mar Haliotis.
• Resultados:
• Glúcidos y glicoproteínas: rosa intenso o fuscia
• Mucopolisacaridos ácidos: azul
AZUL ALCIAN
Este método de tinción se emplea para
detectar polisacáridos en tejidos, tanto
glucógeno como mucopolisacáridos.
También es una buena tinción para
membranas basales y cartílago. Cualquier
fijador es apropiado para esta técnica.
La combinación del PAS con el azul alcián
nos permite distinguir a los
mucopolisacáridos ácidos, teñidos con el
azul alcián, del resto de mucopolisacáridos.
Se puede usar un
Todos los mucopolisacáridos se tiñen con
colorante de
el PAS.
contraste: safranina
AZUL ALCIAN
El siguiente cuadro contiene tres imágenes del epitelio cilíndrico del intestino delgado obtenidas con MO a
100x. La flecha negra señala la región ocupada con los gránulos de secreción ubicada en el polo apical de
una célula glandular caliciforme.

Técnica de PAS con


hematoxilina. Mediante
Técnica de azul alcian con
Técnica de H-E. El polo esta técnica
hematoxilina. Mediante esta
apical aparece como vacío. comprobamos la
técnica comprobamos que el
Nada nos dice sobre la presencia de hidratos
material secretorio contiene
naturaleza química del de carbono en el
hidratos de carbono
producto de secreción. material a secretar. la
sulfatados o carboxilados.
flecha azul señala la
membrana basal.
Tricromico de Masson
Diferenciación entre tejido muscular y conectivo, por medio de una tincion selectiva
de fibras del tejido conectivo, el acido se une al tejido y conserva su capacidad de
unión con los grupos básicos del colorante.
• El acido disminuye reduce la tinción del citoplasma produciendo mayor atracción
del colorante hacia el tejido conectivo

REACTIVOS
• Solución de hematoxilina férrica de Weigert.
• Solución de escarlata de Biebrich – fucsina ácida:
• 1 cc de ácido acético glacial.
• Solución acuosa de ácido fosfomolíbdico (utilizar ácido fosfotúngstico en la
misma proporción, si se va a teñir con verde luz):
• Solución de azul de anilina o Solución de verde luz al 2%.
• Solución diferenciadora: solución acuosa de ácido acético glacial al 1%.
TRICROMICO DE MASSON
• Requiere mordentaje en Bouin.
• Tincion con hematoxilina férrica.
• Se tiñen las secciones con un tinte ácido como escarlata de Biebrich.
• Todos los elementos acidófilos del tejido tales como el citoplasma, el músculo y el
colágeno se unirán a los tintes ácidos.
• Las secciones entonces se tratan con ácido fosfotúngstico y/o fosfomolíbdico. Ya
que el citoplasma es mucho menos permeable que el colágeno, los ácidos
fosfotúngsticos y fosfomolíbdicos permiten que la escarlata de Biebrich difunda del
colágeno pero no del citoplasma.
• Los ácidos fosfotúngsticos y fosfomolíbdicos tienen numerosos grupos ácidos que
probablemente actúen como medio de unión entre el colágeno y el (verde luz)
azul de la anilina, que es el tinte del colágeno.
• Probablemente, el pH de la solución fosfotúngstico/fosfomolíbdico también
aumente la coloración y ayude al colágeno en la difusión o el retiro de los colorantes.
• Se usa acido acetico como diferenciador.
TRICROMICO DE MASSON (colagenas)
• Colageno tipo 1: azul oscuro
• Colageno tipo 2 y 3: azul claro
• Tejido muscular: pardo rojizo
• Tejido epitelial: rojizo.
• Nucleos : negro o violeta
• Citoplasma: rojo o rosado

• Fibras de colágeno y mucinas = Azul/verde


• Por tanto, el tejido conjuntivo.

• Estructuras oxidadas + Citoplasma = Rojo.


• Se teñirán de rojo la queratina, los glóbulos rojos, nervios y el tejido muscular.

• Núcleo celular = Lila, marrón


Figura 3: corte transversal del segmento epididimario del conducto
deferente. Las células musculares (flecha) del estrato medio muestran
una disposición espiralada, el colágeno se tiñe de verde. Tinción
tricrómico de Masson (400x)
• Microfotografías de
Cortes Histológicos
de Molares
Tricromico de Van Gieson (COLAGENOS)

• Las coloraciones tricrómicas, son tinciones especiales que permiten visualizar claramente las
fibras de colágeno tipo I que forman fibras gruesas o haces, diseñados para dar resistencia; en
menor intensidad se tiñen las fibras reticulares. Se emplean tres colorantes para diferenciar los
núcleos, citoplasma y las fibras de colágeno.

• Es una tinción donde se combina la tinción nuclear mediante la hematoxilina férrica de


Weigert con la mezcla ácido pícrico-fucsina ácida la cual permite diferenciar
cromáticamente las fibras colágenas del tejido conjuntivo.

Tricrómico de Van Gieson.


Resultados: Colágeno: rojo rosado.
Células: Músculo: amarillo anaranjado.
- Núcleos: negro - azul Citoplasma: amarillo anaranjado.
- Citoplasma: amarillo Núcleos: negro azulado.
Colágeno: rojo intenso Citoplasma: rosado.
Piel humana, objetivo 40X
Tricrómico de Van Gieson
• Sección de 8 µm de grosor de una muestra incluida en parafina teñida con tricrómico de Van Gieson. Zona profunda de la dermis.
GRACIAS