Mayor biosíntesis de arginina y menor perfil

proteolítico como indicadores del estrés de

saccharomyces cerevisiae en fase estacionaria
durante la fermentación de mosto de uva con alto
contenido de azúcar: una evidencia proteómica.

Jonattan González Guerra

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
PROGRAMA DE QUÍMICA
MONTERÍA
2018
 RESUMEN
acetato y glicerol
buena adaptación

crecimiento bajo

Etanol, nitrógeno
información metabólica
 INTRODUCCIÓN

En particular

Los factores ambientales

 pH En todas estas etapas,
 temperatura las células de levadura
 potencial redox sufren estrés como:
 osmolaridad  baja temperatura
 estrés osmótico
La presente investigación tiene como objetivo arrojar luz sobre  anaerobiosis
los efectos desencadenados por el estrés de la fase de  falta de
fermentación tardía en los perfiles de proteínas de S. cerevisiae nutrientes
ISE19.  estrés por etanol
 MATERIALES Y MÉTODOS
 Estrategia global

Análisis proteómicos
comparativos de un
productor de alto se realizó la recolección
Centro de Investigación
contenido de glicerol y de cultivos Enologia (Asti,
Vitivinícola CREA
acetato, a saber, la Italia)
cepa ISE 19 de S.
cerevisiae.

El procedimiento se
realizó en el mosto de la
en las fases avanzadas
uva Cortese natural con
de la fermentación.
un contenido regular y
alto de azúcar.
 Condiciones de fermentación

Posteriormente se inoculó, a una Los principales parámetros del

S. cerevisiae ISE 19 se mosto fueron: pH 3.30, 200 g / L
concentración de 5 * 106 células / ml
precultivó en YPD a 26 ° de azúcar reductor y 200 mg / L
en mosto de uva blanco Cortese
C durante 48 h. de Nitrógeno Asimilable en
esterilizado con filtro de 0,22 μm.
Levadura (YAN).

el último (ISE19g +) se analizó Se probaron dos

El primero (ISE19g-) se
añadiendo glucosa / fructosa al 50% p condiciones diferentes
probó con una cantidad
/ p al mosto hasta alcanzar 260 g / L en el estudio proteómico
regular de azúcar (200 g
de azúcar y restaurando el YAN a 200 comparativo.
/ L)
mg / L.

el crecimiento densidad óptica (OD) a

eluyente: agua
Las fermentaciones se 600nm.
temperatura de la columna: 85 °
realizaron a 20 ° C sin etanol y acetato análisis Cond.a
C
agitación, y se enzimático.
flujo: 0,35 ml / min
establecieron tres el contenido de azúcar residual
volumen de inyección: 20 μL
réplicas biológicas. (glucosa y fructosa) y glicerol
HPLC.
 Preparación de los extractos proteicos
Las células de levadura La lisis celular se obtuvo
(50 ml de se centrifugaron (5000 x volviendo a suspender el
aproximadamente 9 * g durante 20 minutos) y sedimento con 3 ml de
107 células totales / ml) el sobrenadante se tampón de lisis (Tris-HCl
se lavaron con 50 ml de descartó. 50 mM, pH 7,3, EDTA 1
una solución de NaCl al mM).
0,85%.

el sobrenadante se añadiendo un volumen

Al final del procedimiento, se
transfirió a un nuevo vial igual de perlas de vidrio
realizó la centrifugación (5000
para la cuantificación de 0,5 mm para romper
× g durante 20 min a 4 ° C).
total de proteínas. las células.

La cuantificación de
proteínas se realizó las muestras de proteínas se
utilizando el "kit 2D ultracentrifugaron (100.000 ×
Quant" (GE Healthcare) g durante 1 hora a 4 ° C).
(análisis UV a 480 nm)
 Se recuperó el sobrenadante que
contenía las proteínas solubles, se
suplementó con 10 μL / mL de
Nuclease Mix (GE Healthcare) y se
dializó.
Se realizó una segunda cuantificación,
seguida de la precipitación de la
proteína metanol / cloroformo

El sedimento obtenido se solubilizó a

continuación en una solución de
La concentración de proteína se evaluó
rehidratación (urea 6,5 ​M, tiourea 2,2 M,
nuevamente usando el kit 2D Quant
CHAPS al 4% p / v, Tris-HCl 5 mM, pH 8,8,
(GE Healthcare).
tampón IPG al 0,5% (GE Healthcare), DTT 100
mM
 Electroforesis bidimensional
Se llevaron a cabo tres réplicas
Se usaron tiras de 13 cm técnicas para cada una de las Se
de largo, en un rango tres réplicas biológicas en las dos cargaron aproximadam
de pH de 4 a 7 , para condiciones de fermentación ente 275 μg de proteínas
Isolectric Focusing (IEF). diferentes (glucosa enriquecida y extraídas para cada tira
control).

se enriquecieron con DTT 10 mM,
Posteriormente se incubaron
durante 15 minutos en un tampón
de alquilación ( urea 6 M, glicerol
al 30% v / v, SDS 2 v / v, Tris-
HCl 50 mM pH 8,6)
Las tiras de IEF se incubaron a
temperatura ambiente durante
15 minutos en un tampón de
reducción ( urea 6 M, glicerol
al 30% v / v, SDS al 2% p / v, Tris-
HCl 50 mM pH 8,6).
IEF se realizó utilizando
IPGphor (GE Healthcare)
a 20 ° C, con 66,000 Vh,
a 8000 V, después de
10 h de rehidratación
activa (50 V).

se enriquecieron con
yodoacetamida al 4,5% p / v
para alquilar el grupos de
sulfuro y prevenir la re-oxidación
durante la electroforesis.
  SDS-PAGE(electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico)

Después del equilibrado, las tiras SDS-PAGE se llevó a cabo

se sellaron en la parte superior para cada muestra en 11,5% El tampón de ejecución
de geles de segunda dimensión T y 3,3% C acrilamida fue Tris 25 mM, glicina 192 m
verticales de 1,00 mm con 0,5% (Biorad) en geles M, SDS al 0,1%, pH 8,3.
de agarosa en ebullición. homogéneos.

Las condiciones de funcionamiento

fueron:
El marcador de peso  voltaje constante de 600 V, 20 mA /
molecular utilizado fue un kit gel, 60 W durante 15 minutos a 15 °
de calibración de C,
electroforesis Low M r (GE  voltaje constante de 600 V, 40 mA /
Healthcare). gel
 80 W durante aproximadamente 2,5
ha 15 ° C
Los geles se tiñeron
automáticamente, usando Después de 12 h de tinción,
Processor Plus , con los geles se secaron en un
colorante azul de Coomassie sistema secador GD 2000
coloidal recién preparado Vacuum Gel.
  Análisis de imagen

Se adquirieron imágenes de
gel 2-DE usando un
densitómetro personal SI
Molecular Dynamics.

El análisis de la imagen se
realizó utilizando el software
Progenesis PG 220 .

El análisis de la imagen se
realizó utilizando el software
Progenesis PG 220 .
  análisis estadístico

Se realizaron nueve réplicas para

se llevaron a cabo tres réplicas
cada gel 2-DE, y para cada
analíticas para cada réplica
condición (contenido de azúcar
biológica.
alto y normal en los medios de
cultivo).

Los volúmenes puntuales se
analizaron estadísticamente
mediante la prueba t de Student.
Se midieron las
intensidades puntuales , a través
de volúmenes de punto
normalizados, utilizando el sistema
de estandarización de "cantidad
total en punto válido“.

Se seleccionaron puntos de
los valores medios se
proteína con un cambio de
consideraron significativamente
pliegue ≥ 2 yp < 0,05 para el
diferentes cuando p < 0,05
análisis de MS.
  Análisis de espectrometría de masas e identificación de proteínas

Las manchas retiradas de los

Los puntos seleccionados se
identificaron mediante
espectrometría de masas MALDI-
TOF / TOF.
geles de 2DE se destiñeron
durante la noche (con
una solución de bicarbonato
de amonio 50 mM y etanol al
40% v / v).

se lavaron tres veces durante

El paquete de software MS-Fit se 10 minutos con acetonitrilo y
usó para buscar en la base de luego se secaron en un
datos de NCBI 2015.3.10, dispositivo Speedvac.
utilizando el método de huella
dactilar masiva de péptidos
(PMF).
Las proteínas se digirieron en
Y sus espectros se adquirieron gel con tripsina
como se describe por Zava et
al. (2009) .
 RESULTADOS

 Rendimiento de la fermentación
 alcanzó un máximo de
aproximadamente 120 × 10 6 células
/ ml después de seis días.(alto
contenido de azúcar).

 crecimiento máximo de
100 × 10 6 células / mL, que se
alcanzó después de siete días

 A partir del día 14, la población de

levadura tendió a disminuir en
ambas condiciones de azúcar

 alcanzó valores similares el día 21.

 0.60 ± 0.03 g / L después de 7 días

0.68 ± 0.03 g / L al final

0.5 ± 0.02 g / L de acetato al final de la fermentación

alcanzó 7,0 ± 0,12

6,30 ± 0,28

glicerol mostró una tasa de biosíntesis

más regular en comparación con la
producción de acetato
 Estudios proteómicos comparativos

 El perfil de proteínas productoras de acetato y glicerol en contenidos altos y normales de

glucosa se analizaron en un momento crítico del crecimiento celular(estrés osmótico ,
etanol y nitrógeno).

 Las muestras se cosecharon en la fase estacionaria ( Fig. 2 ), cuando se produjeron 10.5%

v / v de etanol en ambas condiciones.

 los azúcares residuales restantes fueron 25 y 85 g / L en ISE19g e ISE19g +,

respectivamente.

 Las concentraciones de proteína al final del proceso de extracción fueron

9.97 ± 0.71 μg / μL en ISE19g - y 11.78 ± 0.75 μg / μL en ISE19g +.
 Identificación de la proteína
28 puntos abundantes diferentes
estadísticamente significativos.

Tres manchas estaban ausentes

en la condición de alto
contenido de azúcar.

cuatro puntos estaban presentes

exclusivamente en la condición
de alto contenido de azúcar.

De las manchas restantes, 7

estaban presentes en mayor
abundancia.
Y 14 presentes en menor
abundancias.
 DISCUSIÓN

 Los perfiles de expresión de proteínas de S . Cerevisiae ISE19

 La condición de desequilibrio entre el contenido de azúcar de mosto y la

presencia de nitrógeno asimilable de levadura (YAN) se ha reconocido
como la principal causa de las detenciones fermentativa
 la fermentación con mayor contenido de azúcar mostró inicialmente un mejor
desempeño, tanto en términos de producción de etanol como de crecimiento celular.

 La diferencia de 60 g / l en la carga inicial de azúcar en el jugo no dio lugar a ninguna

extensión de la fase de latencia.

 En esta etapa inicial, la cepa ISE19 probablemente se vio favorecida por una mayor
disponibilidad de fuente de carbono, mientras que la concentración de nitrógeno aún
no era un factor limitante
 La fermentación atascada, que se produjo al 13,40% de etanol al final de la fase
estacionaria, se debió supuestamente a la baja disponibilidad de nitrógeno, que se sabe
que es un fuerte factor limitante.

 debido a la mayor concentración de azúcar y la buena osmotolerancia de esta cepa, el

rendimiento de biomasa fue mayor.

 En esta condición, hay una mayor necesidad de nitrógeno para apoyar el crecimiento

 la presencia concomitante de varios factores estresantes, es decir, un alto contenido de

etanol, la presión osmótica de los azúcares residuales y la acumulación de compuestos
tóxicos, como los ácidos grasos de cadena media, pueden haber contribuido a la
desaceleración de la eficiencia fermentativa
 detención de la fermentación, el principal azúcar presente fue fructosa.

 debido a la menor afinidad de los transportadores de hexosa (HXT) con fructosa y las
diferencias en la eficacia de la actividad de las hexocinasas (HXK) hacia este azúcar.

 la principal respuesta de las células de levadura a la osmolaridad alta es la producción

de glicerol, el mejor estabilizador del equilibrio osmótico.

 Se ha demostrado que la acumulación de glicerol representa el 95% de la recuperación

de la osmolaridad interna.
 la producción de glicerol durante la fermentación es el resultado del mecanismo de
control del equilibrio redox creado para oxidar el exceso de NADH producido en la
formación de 1,3-difosfoglicerato a partir del 3-fosfato gliceraldehído en la glucólisis.

 las proteínas reguladoras K7_Bmh2p (punto 1687B) y K7_Bmh1p (punto 1689B), que
controlan la formación de las vesículas implicadas en el transporte y la exocitosis, se
encontraron presentes, pero solo en la condición hiperosmótica.

 están involucradas en la protección contra la apoptosis inducida por estrés, y juegan un

papel importante en el control post-transcripcional de las proteínas de levadura.
 Los resultados globales relativos a la glucólisis (en las células cultivadas en el medio
hiperosmótico) sugieren:

 i) una activación inicial del flujo glucolítico, debido a una mayor abundancia de
fructosa 1,2 bifosfato aldolasa.

 ii) una ligera desaceleración de la glucólisis, debido a una disminución de la abundancia

de triosa-fosfato isomerasa, que probablemente favorece la síntesis de glicerol.

 iii) una activación de la conversión de 2-fosfoglicerato a PEP mediante la biosíntesis

mejorada de Eno2p (la enzima glucolítica) y una disminución de la abundancia de
Eno1p (el gluconeogénico enzima).
 Se encontró que tres fragmentos que se originaban de Pdc1p (punto 1354A), Fba1p
(1500A) y Eno1p (1507A) eran menos abundantes o estaban totalmente ausentes en un
medio hiperosmótico.

 dos sintasas de arginina-succinato postraduccionalmente diferentes (Arg1p) (mancha

1358B, pI 5.8 y mancha 1577B pI 5.6) fueron más abundantes (hasta 10 veces) en la
condición de alto contenido de azúcar.

 Xu y colaboradores (2011) demostraron que la argininapodría proteger la

levadura Candida glabrata durante el estrés hiperosmótico
 Una glucosiltransferasa, implicada en la síntesis de mananos de pared celular (proteína
similar a YJR075Wp) (mancha 1688B), solo estaba presente en la concentración alta de
glucosa.

 lo que sugiere la necesidad de procesamiento y renovación de la pared celular durante

el estrés hiperosmótico.

 Los presentes hallazgos están de acuerdo con estas observaciones y confirman que el
estrés oxidativo es un evento estadísticamente raro cuando los azúcares son abundantes
y, por lo tanto, no se consumen por completo.
 CONCLUSIÓN

 La fermentación alcohólica y gliceropirúvica están estrechamente

relacionadas durante la elaboración del vino.

 En promedio, el 8% de los azúcares debe someterse a la fermentación

glyceropyruvic, mientras que la parte restante se convierte en etanol.

 La capacidad de producir glicerol varía según la cepa de levadura y, por

lo tanto, puede afectar el porcentaje de glicerol y etanol formado por la
misma cantidad de azúcares fermentados.
 se detecto una mejora global de la abundancia de las proteínas implicadas en la
fermentación alcohólica, la síntesis de la pared celular, los aminoácidos aromáticos y
la biosíntesis de arginina .

 No se ha observado un aumento aparente en la abundancia de proteínas de estrés y la

proteolisis parece estar modulada negativamente en condiciones hiperosmóticas.
 BIBLIOGRAFÍA

 Ahmadpour, D., Geijer, C., Tamás, M. J., Lindkvist-Petersson, K., & Hohmann, S.
(2014).
 Yeast reveals unexpected roles and regulatory features of aquaporins and
aquaglyceroporins.
 Biochimica et Biophysica Acta, 1840, 1482–1491.
 Alexandre, H., Ansanay-Galeote, V., Dequin, S., & Blondin, B. (2001). Global
gene expression
 during short-term ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters, 498,
98–103.
 Ansell, R., Granath, K., Hohmann, S., Thevelein, J. M., & Adler, L. (1997). The two
isoenzymes for yeast NAD+-dependent glycerol 3-phosphate dehydrogenase
encoded by
 GPD1 and GPD2 have distinct roles in osmoadaptation and redox regulation.
EMBO J. 16, 2179–2187.
 in different Saccharomyces cerevisiae wine yeast strains. Applied Microbiology and
Biotechnology, 77, 1083–1091.
 Bisson, L. F. (1999). Stuck and sluggish fermentations. American Journal of Enology and
Viticulture, 50, 107–119.
 Boer, V. M., de Winde, J. H., Pronk, J. T., & Piper, M. D. (2003). The genome-wide
 transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic
 chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. The Journal of
 Biological Chemistry, 278, 3265–3274.
 Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., & Rozès, N. (2015). New
 insights into the toxicity mechanism of octanoic and decanoic acids on Saccharomyces
cerevisiae. Yeast, 32, 451–460.
 Capaldi, A. P., Kaplan, T., Liu, Y., Habib, N., Regev, A., Friedman, N., & O'Shea, E. K.
 (2008). Structure and function of a transcriptional network activated by the MAPK Hog1.
Nature Genetics, 40, 1300–1306.
 Christ, A., Kowalczyk, A., Zuchowska, M., Claus, C., Löwenstein, R., Szopinska-Morawska,
 A., ... König, H. (2015). An exemplary model study for overcoming stuck fermentation
 during spontaneous fermentation with the aid of a Saccharomyces triple hybrid. The
Journal of Agricultural Science, 7, 18–34.
 Auesukaree, C. (2017). Molecular mechanisms of the yeast adaptive response and
tolerance
 to stresses encountered during ethanol fermentation. Journal of Bioscience and
Bioengineering, 124, 133–142.
 Berthels, N. J., Otero, R. R. C., Bauer, F. F., Pretorius, I. S., & Thevelein, J. M. (2008).
 Correlation between glucose/fructose discrepancy and hexokinase kinetic properties
GRACIAS