Seminario 3.

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
Cromatografía de líquidos de alta eficiencia

o633c6h12o6@gmail.com
Mayo, 2018
1903
Mikhail Tsvet
Éter de petróleo Inulina
Introducción
Cromatografía de adsorción
Cromatografía sólido-líquido (LSC)
1900-1970´s Fases estacionarias:
Carbonato de calcio
Alúmina (óxido de aluminio) Fases estacionarias “normales”
Magnesia (óxido de magnesio) tienen carácter polar.
Silicatos de magnesio (Florisil)
Tierras diatomeas (Celita y Diatomita)

1970´s Desarrollo de Sílice sintética

Desarrollo de fases reversas para HPLC
Sílice
Uso como fase estacionaria
• Menos reacciones no deseadas durante la separación de la muestra
• Partículas fuertes, con control de tamaño y porosidad - Soporta
presiones HPLC
• Mayor superficie de área (mayor capacidad de carga)
• Mayor pureza y reproducibilidad (repetibilidad en separaciones)
• Costo y disponibilidad
Aplicación actual
Cromatografía en fase “normal”
1. Separaciones analíticas por cromatografía en capa fina (TLC)
2. Limpieza y purificación de muestras crudas (SPE)
3. Resolución de mezclas con isómeros aquirales (HPLC)
Selectividad LSC
Homólogos Columna C18
f.m. (40% metanol/agua)
Columna de alúmina
f.m. (5% éter/pentano)

C1 k’=4,8 C1 k’=3,3
C4 k’=4,1 C2 k’=6,5
C10 k’=3,6 C4 k’=17
Selectividad LSC
Benzólogos Valores de α
NPC RPC
1,2 1,4

1,1 1,8

NPC sílice, f.m. (1% isopropanol/hexano), RPF C18 (40% metanol/agua)

 Selectividad LSC
Isómeros Valores de α
NPC RPC
12,5 1,06

NPC sílice, f.m. (1% isopropanol/hexano), RPF C18 (gradiente metanol/agua)

Selectividad LSC
Isómeros

m-Dibromobenceno p-Dibromobenceno
k’=3,8 k’=6,9

Columna de alúmina, f.m. (Pentano)

Selectividad LSC
Isómeros

Quinolina Isoquinolina
k’=5,4 k’=18,6
Columna de alúmina, f.m. (Benceno)
Selectividad LSC
Isómeros

1,2,3,4-Dibenzantraceno Piceno
k’=0,6 k’=12,0
Columna de alúmina, f.m. (CH2Cl2)
Selectividad LSC
Tipo de compuesto

2-Metoxinaftaleno 1-Nitronaftaleno 1-Cianonaftaleno 1-Acetonaftaleno

k’=0,6 k’=1,8 k’=2,7 k’=5,5
Columna de sílice, f.m. (23% CH2Cl2/pentano)
Selectividad LSC
Número de grupos funcionales

2-Metoxinaftaleno 1,7-Dimetoxinaftaleno
k’=0,6 k’=1,4

Columna de sílice, f.m. (23% CH2Cl2/pentano)

Selectividad LSC
Número de grupos funcionales

1-Nitronaftaleno 1,5-Dinitronaftaleno
k’=1,8 k’=6,1
Columna de sílice, f.m. (23% CH2Cl2/pentano)
Selectividad LSC
Número de grupos funcionales

Acetofenona 3-Nitroacetofenona
k’=1,1 k’=1,6
Columna de sílice, f.m. (60% CH2Cl2/pentano)
Selectividad LSC
Derivados de anilina
Octadecilo

Sílica-Ciano
Selectividad LSC
Derivados de anilina

Rango en k’ = k’j/k’i
La adsorción es un fenómeno de adhesión superficial, contrario a
la absorción que es un fenómeno de volumen.

Adsorción Absorción
Vs
Fases estacionarias
Características de las fases estacionarias

Tipo de adsorbente(sílice, alúmina, carbón grafitizado)

Área superficial
Geometría de la partícula (diámetro, porosidad (5-10 µm))
Contenido de agua en el adsorbente
Diámetro de poro
Fuerza superficial o actividad
Sílice (dióxido de silicio – SiO2)
Ligeramente ácida ≈ pH 5
Sensible a concentraciones de agua
Rango estable de pH 2 – 7
Resistencia mecánica
Mayor área superficial (300 – 400 m2/g)
Retención preferencial de compuestos básicos
Sílice
Grupos silanol en la superficie
Asociados a bajos valores
de N e incremento de
coleo en analitos básicos

Al(III) y Fe(III) contaminantes que

incrementan la acidez de la
sílice

Sílices completamente hidratadas

[-SiOH]8 μmol/m2 . Responsables de la acidez de la columna,
Sílice
Trazas de metales en una columna
Zorbax Rx-SIL
Alúmina (óxido de aluminio – Al2O3)
Alúmina básica ≈ pH 12
Sensible a concentraciones de agua
Retención mayor de compuestos ácidos
Menor resistencia mecánica
Amplio rango pH
Orden general de elución

Hidrocarburos saturados < olefinas < hidrocarburos

aromáticos=aluros orgánicos < sulfuros <éteres <
nitrocompuestos < ésteres = aldehídos = cetonas < alcoholes =
aminas < sulfonas < sulfóxidos < amidas < ácidos carboxílicos

k’ pequeños → k’ grandes
Selectividad de las fases estacionarias
Tipo de muestra k’ sílice / k’ alúmina
Naftalenos sustituidos
-OCH3, -NO2, -CO2CH3, 0,9-1,2
-CN, -CHO, -COCH3
Compuestos básicos
2-Cloroquinolina 3,9
N-Metilanilina 1,9
Compuestos ácidos
Pirroles 0,06
Fenoles 0,0002-0,02
Tiofenoles 0,00001
Hidrocarburos aromáticos
0,1
Piceno
FASES MÓVILES
Teoría de equilibrio
Є0= 0,42
Teoría de equilibrio THF Є0= 0,45

Grupo fenilo no
compite por la
fase estacionaria

Adsorción
localizada
Fuerza de eluyente (ε )
0

0 log(𝑁𝑏 10∝𝑛𝑏 𝜀𝑏 −𝜀𝑎 + 1 − 𝑁𝑏

𝜀𝑎𝑏 = 𝜀𝑎 +
𝛼𝑛𝑏
La fuerza de eluyente o fuerza de elución (ε0), de un
disolvente es una medida de la energía de adsorción
del disolvente tomando como referencia el sistema
pentano-sílice
Fuerza de eluyente (ε )
0

∝𝑛𝑏 𝜀𝑏 −𝜀𝑎
0 log(𝑁𝑏 10 + 1 − 𝑁𝑏
𝜀𝑎𝑏 = 𝜀𝑎 +
𝛼𝑛𝑏
ε0 = Fuerza del solvente o mezcla
Nb = Fracción molar de B en la mezcla
n = Tamaño molecular de B
α = Constante que depende de la actividad del
adsorbente o del contenido de agua (0,6<α<1,0)
Fuerza de eluyente (ε )
0
Un cambio en de 0,05 en ε podría
producir cambios en k’ en un factor
de 2

aInmiscible con hexano

bLocalizado no básico
c No localizado
dLocalizado básico
Diagrama de energía de eluyente vs log k’ para el nitrobenceno
y el fenantreno, columna de sílice (f.m. cloroformo/hexano)
Nomograma de fuerza de eluyente (ε0)
Selectividad de la fase móvil
Efecto de la concentración de B
Los valores máximos de α se obtienen generalmente para valores muy
grandes o muy pequeños en la concentración del solvente B

k’ α
 1 2

3 4

5 6

f.m. Acetato de etilo (B) /Ciclohexano (A) – Columna sílice

 Selectividad de la fase móvil
Efecto del enlace de hidrógeno
Cualquier cambio en la fase móvil que resulte en un cambio en interacciones
tipo enlace de hidrógeno entre la f.m. y la muestra, tendrá como resultado
grandes cambios en α

(A) Pentano, alúmina

Selectividad de la fase móvil
Efecto del enlace de hidrógeno
Cualquier cambio en la fase móvil que resulte en un cambio en
interacciones tipo enlace de hidrógeno entre la f.m. y la muestra,
tendrá como resultado grandes cambios en α
 Selectividad de la fase móvil
Efecto del enlace de hidrógeno
Cualquier cambio en la fase móvil que resulte en un cambio en
interacciones tipo enlace de hidrógeno entre la f.m. y la muestra, tendrá
como resultado grandes cambios en α
Ligera tendencia a
donar protones

(A) Pentano, alúmina

 Ventajas de la adición de agua

Menor variación de tiempos de retención

Incremento de capacidad de carga para separaciones isotermas
Aumento en la eficiencia de la columna (reducción de coleo)
Compensación de diferencias entre lotes de adsorbente
Reducción en la tendencia del adsorbente a catalizar reacciones no
deseadas
 Efecto de adición de agua

Θ0.1 Capacidad lineal del sistema cromatográfico

f.m. Diclorometano, Zorbax-Sil (8 µm), 25*0.32 cm
 Solventes isohídricos o isoactivantes
Solventes saturados al 100%, producen un cambio en el
fenómeno de retención LSC a LLC.

Saturación ideal de agua en columna de sílice es 50%, alúmina

25%

Fases móviles con agua provocan tiempos de equilibrio largos

(no isohídricos)
 Solventes isohídricos o isoactivantes
Fases móviles con agua provocan tiempos de equilibrio largos

Diclorometano/pentano
Alúmina

Saturación H20 inicial 50%

Saturación H20 final 75%

f.m. no isohídricas
Solventes isohídricos o isoactivantes
Isohídricos, solventes con la misma saturación de agua,
reducen tiempos necesarios para alcanzar el equilibrio en la
columna

50% H20 Éter etílico – 50% H20 Diclorometano

20 -30 Vm para equilibrio
Solventes isohídricos o isoactivantes
Preparación de un solvente isohídrico
Mezclar
Mezclar
Agitar Sílice hidratada (10-20
Sílice + 30% H2O g) + Solvente seco

Agitar 10
min
Mezclar solvente
SOLVENTE hidratado (100%) +
CONCENTRACIÓN 50% Resultado Solvente seco
1:1
Uso de modificadores orgánicos
Modificadores comunes: Metanol, acetonitrilo e
isopropanol
MUCHAS GRACIAS
La

 Los compuestos muy polares requieren ajustens de las condiciones

cromatográficas para disminuir el coleo de bandas y los bajos valores de
N.
 No se usa para la separación de compuestos iónicos.
 Muestras con poca solubilidad en agua o en solventes miscibles en agua,
comúnmente se resolvían mejor por cormatograf+ia solido liquido
 Los empaques en LSC son mas económicos que los empaques de fases
enlazadas.
 Compuestos de diferente naturaleza química se separan fácilmente en
silica o en alumina. (Ver tabla 9,1) Snyder viejo

 El punto a favor de esta técnica frente a las otros métodos

cromatográficos , es la separación de mezclas isoméricas

 La diferencia principal entre fase normal y fase reversa, radica en la

separación de homologos, benzologos e isómeros.
Homologos se separan mucho mejor en fase reversas o cromatografía polar
con fases enlazadas.
 Benzologos también se separan en ambas columnas, pero su separación
es mejor en fase reversa,
Ver tabla 9,2, la adición de un grupo benxo incrementa k’ en un factor de 1.1
a 1.2 en LCS. y 1.4 a 1.8 veces en fase reversa.
El incremento de k´al adicionar anillos aromáticos es mayor en LSC para
compuestos menos polares.

 Separación de isómeros. Es mucho mejor en fase normal que en fase

reversa.
¿Por qué la silice?

 Permite mayores cargas de muestra

 La formación de reacciones no deseadas durante la separación
 Se encuentra disponible en un amplio rango de formas útiles para la
cromatografía.

Existen direfencia en la selectividad de las fases, mayor afinidad de la silice

por compuestos básicos y mayor afinidad de la alumnia por los compuestos
+acidos. Los hidrocarburos aromáticos también se retienen bien en alumina y
ojo con usar los ácidos caróboxílicos en las fases con alúmina pues se retienen
tanto que puede llegat a ser irrrebersible.
"pgcllas@unam.mx" <pgcllas@unam.mx>, "hdezwill28@comunidad.unam.mx" <hdezwill28@comunidad.unam.mx>, "rogeriosquimica@gmail.com" <rogeriosquimica@gmail.com>, "xdxexe@live.com" <xdxexe@live.com>

 La silice es ligeramente ácida

 La alumna tiene carácter básico.

Muestras que son suceptibles a reaciones catalizadas por ácidos o por bases, no pueden exponerse al absorbente que
promueva alteración no deseada de sus componentes.

Ph de la alúmina es de 12. Si las muestras son sensibles a la presencia de bases se presentan problemas de reacciónes no
desadas

El pH de la sílice es de 5, así pocas reacciones catalizadas por ácido se llevan a cabo en la superficie de la sílce.

<neyraccq@outlook.com
 Silica no se usa pa compuestos catiónicos por su carácter ácido, o en
compuestos con grupos con carácter básico. Se producirán interacciones
muy fuertes entre los grupos silanol y los grupos catiónicos o básicos.
 Ventaja de la silice facilidad para variar su superficie ( superficie de área,
diematro promedio de poro, contenido de agua).

 El área superficial de una columna es una medida de la cantidad de fase

estacionaria en la columna. Los valores de k´son directamente
promorcionales al área superfical del adsorvente
 400 m2/g área superficial promedio en la silice porosa. Valores mayores se
pueden alcanzar pero el diámetro de los poros seria menor que 10 nm, lo
cual poca transferencia de masa disminuye el valor de N. Menores
superficies limitan la cantidad de muestra que se puede insertar en el
sisema y disminuyen la detección.

 Ver CAP 5 Efectos de tamaño de partícula sobre otras cosas =)

 Truco para sustancias muy retenidas tulizr presicsamente bajas superficies
de área. Las bajas áreas superficiales se acondicionan más rápido
después de un gradiene de elución, pero obviamente no es una solución
económica
Agua en la superficie de las silices

 A. químicam ente combinada en la superficie en forma de grupos silanol.

 B: como agua molecular la cual se absorbe en silianol.

 Las sílices se preparan calentando entre 200 y 300 °C lo cual garantiza una
cobertura máxima de las superfice con grupos hidroxilos.
FASES MÓVILES

 La decisión más importante para una sepaació cromatográfica es la

selección de la fase móvil.

 FUERZA DEL SOLVENTE E°

Esta definida cuantitativamente para un adsorbente dado, es la energía de
adsorción por unidad de área para el solvente.
Incrementa E°, incrementa la energía de solvente y una reducción de k’ para
todas los picos de la muestra. Son similares en silice y alúmina.
BUSCAR TABLAS CON FUERZA DE SOLVENTE
Fuerza eluyente

 Evaluación de las mezclas binarias y sus respectivas fuerzas eluyentes

 No tiene una variación lineal

log(𝑁𝑏 10𝑛𝑏 ∈𝑏 −∈𝑎

+ 1 − 𝑁𝑏
∈0𝑎𝑏 =∈𝑎 +
𝛼𝑛𝑏

𝛼= Constante que varia con la actividad del adsorbente o con el contenido

de agua (0,6<𝛼<1,0)
𝑛𝑏 = Varía con el tamaño molecular de B (4<𝑛𝑏 <6)
𝑁𝑏 = Fracción molar de B
Relacion entre selectividad B-
concentration rule
Enlaces de hidrogeno efecto

Selectividad de la fase móvil dependerá e estos dos factores… normalmente

el solvente A, que es aquie con fuerza elugente menor que 0,2… no tiene
tanto efecto en el cambio en selectividad.. Es mas claro el efecto por cambio
en b
Adicion de agua o modificadores de
polaridad a la fase móvil
 Es práctica común agregar pequeñas cantidaddes de agua o de un
modificaor de polaridad como metanol, a la fase móvil. Estos compuestos
se adsorben preserencialmente en los sitios de adsorción fuertes.
 Desactivación de adsorbentes,
 Beneficios. Menores variaciones en los tiempos de retención de corrida a
corrida, incremente sustancial en la capacidad de carga para
separaciones isotermas. Mayores eficiencias en la columna y reducción
de tailing en algunos casos.
 Compensacion en diferencias de lote en adsorbentes del mismo tipo
 Reduccion de la tendencia del adsorente a catalizar reacciones no
deseadas durante la corrida cromatográfica.
Agregar agua =)

 Si agrego agua a una fase móvil anhídrida, mejoro la reproducibilidad,

porque el solvente variará su concentración de agua naturalmente
debido a tres factores.
 El contenido inicial de agua en un solvente que se supone seco puede
variar un poco.
 El agua se incorpora rápidamente a partir de la atmósfera
 Puede ocurrir cambios en el contenido de agua en la fase móvill como
resultado del contacto con las paredes de contendedores intermediarios.
SOLVENTES ISOHÍDRICOS
ISOACTIVANTES
 Se sugiere saturación de agua en columnas de sílice en 50% y del 25% en
columnas con alúmina,
Energía de adsorción y retención de
acuerdo a características de las moléculas