Universidad de Guadalajara

Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierías

Licenciatura en Ingeniería en Alimentos y Biotecnologías.

Nuevas Biotecnologías
Mtra. Brenda Aranda Jaramillo
Alumnos
Gutiérrez Navarro Ángel Daniel
Heredia Ledesma Ricardo Andrés
Mercado Serna Diana
Peña Rubio Daniel Enrique
HIBRIDACIÓN
IN SITU
CONTENIDO

• Introducción
• ¿Que es la hibridación in situ?
• Embebido o inclusión en parafina
• Proceso
– Etapa 1
• Tipos de sonda
• Tiopos de marcaje
– Etapa 2
– Etapa 3
– Etapa 4
• Referencias
INTRODUCCIÓN
El método de hibridación in situ se
ha convertido en una técnica
importante en diversos campos,
incluyendo diagnóstico de rearreglos
cromosomales, detección de
infecciones virales y análisis de la
función génica durante el desarrollo
embrionario

Rearreglo cromosómico implica la reubicación de un gen, que pasa de un sitio donde se

encuentra reprimido a otro de transcripción y síntesis activa.
¿QUÉ ES LA HIBRIDACIÓN IN SITU?

Asociación de dos moléculas con cierto grado de

complementariedad.

Hibridación in situ
En sitio
¿QUÉ ES LA HIBRIDACIÓN IN SITU?

La hibridación in situ es una técnica de laboratorio que consiste en marcar

una hebra sencilla de ARN o ADN denominada sonda y permitir que se
empareje con su secuencia complementaria en el ARN o el ADN presente
en una muestra de tejido o de cromosomas. La sonda está marcada con una
sustancia trazadora química o radiactiva por lo que su unión puede ser
visualizada.
HISTORIA DE LA HIBRIDACIÓN IN SITU

La técnica fue desarrollada en 1969 por Joseph Gall

Gall y colaboradores formularon una técnica que formaba híbridos moleculares entre RNA y DNA. La
técnica se llevó a cabo en ovocitos de Xenopus Laevis, hibridando rRNA con rDNA extracomosomal.

En ese momento la única forma de marcaje eran los radioisopos, por lo que se usó tritio para el
experimento y la forma de detección fue por autoradriografia.

Demostraron que en ciertas partes como tejido conectivo, la técnica no era suficientemente sensible
para mostrar las cantidades pequeñas de rDNA en un genoma.

Finalmente propusieron mejorar la técnica, pese a las limitaciones que esto implicaba
HISTORIA DE LA HIBRIDACIÓN IN SITU
Estos experimentos
Uno de los principales
arrojaron información
problemas de la
valiosa que contribuyo
hibridación in situ era
a perfeccionar la
el tipo de marcaje
técnica

La estrategia actual es En 1981 se detectaron

un sistema de en cromosomas
detección con metafasicos el gen de
antecuerpos la insulina.

En 1985 se
sintetizaron
oligonucleótidos
marcados
radioactivamente para
detección
INMUNOCITOQUÍMICA
Pasos fundamentales: 2. A su vez es necesario
Inmunocitoquímica:
1. Se coloca a la muestra emplear un anticuerpo
localización de moléculas
en estudio, el anticuerpo inespecífico marcado,
en cultivo mediante
contra el antígeno que se que reconoce al primer
anticuerpos marcados
desea detectar anticuerpo empleado

Fluorocromos: moléculas
que emiten luz visible
cuando de las ilumina
con una determinada
longitud de onda
INMUNOFLUORECENCIA
EMBEBIDO O INCLUSIÓN EN
PARAFINA
PROCESO

• Preparación de Etapa 2 • Hibridación Etapa 4

sonda marcada
• Fijación • Detección de señal
• Embebido en
parafina
• Seccionamiento de

Etapa 1 Etapa 3
tejido
 ETAPA 1
Preparación de la sonda
Sonda:
Secuencia de nucleótidos COMPLEMENTARIA de la secuencia diana a estudio.

SONDA

Sec. diana

Sonda Antisentido (Antisense)

Sonda Sentido (Sense, control negativo)
 TIPOS DE SONDAS
Naturaleza:
• ADN (bicatenarias)
(Oligonucleótidos son monocatenarias)
• ARN (Ribosondas) (monocatenarias)

MARCADORES
Son moléculas que se incorporan a un nucleótido para permitir la detección de la sonda.
 TIPOS DE MARCAJE
• Método directo:
La sonda se marca con una molécula (flourocromo) que permite visualización inmediata de la señal tras la hibridación.

• Método indirecto:
La sonda se marca con una molécula (digoxigenina o biotina) que requiere de un proceso de inmunocitoquímica para
ser detectada.

El marcaje es independiente del tipo

de molécula marcadora que se use
 ETAPA 2
Fijación, embebido en parafina y seccionamiento del tejido
(Preparación del tejido)

Esto solo se
hará con el
tejido, no con
células

*Fijación: preserva las características del tejido como cuando estaba vivo.
La fijación, habitualmente química, ha de ser optimizada para cada tipo de célula o tejido.

*Embebido o inclusión en parafina: necesario si usamos tejido para endurecerlo y poder

seccionarlo.

* Seccionamiento: se realizan secciones de tejido (7-10 microm) en un micrótomo.

 ETAPA 3
HIBRIDACIÓN DE SONDA

Pretratamiento para la preparación Hibridación

del tejido
Se hibridará conforme a la
1. Inactivación de enzimas endógenas
temperatura de las secuencias que se
2. Hidrolisis y extracción de proteínas detectarán y de la solución de
para aumentar la accesibilidad de la hibridación utilizada.
sonda
 FASE 4
DETECCIÓN DE SEÑAL

Método directo Método indirecto

Visualización de señal Inmunocitoquímica

en microscopio de Visualización de señal
fluorescencia en microscopio
 FASE 4
INMUNOCITOQUÍMICA
Incubación de un Anticuerpo que va marcado a una enzima (Fosfatasa alcalina o
peroxidasa), este anticuerpo es especifico y reconocerá solamente la molécula
marcadora. Tras incubar con este anticuerpo vamos a provocar una reacción
enzimática.
 REFERENCIAS
• Salamanca Gómez, Fabio, 2007. Rearreglos cromosómicos y fusión de genes en tumores sólidos. IMSS,
D.F. Mexico.
• UNAM. HIBRIDACIÓN in situ. Disponible en:
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/hibridacion_in_situ.pdf
• National Human genome research institute (NIH). Hibridación in situ. Disponible en:
https://www.genome.gov/glossarys/index.cfm?id=110
• Gómez Jiménez, María Dolores; Serie: MOOC Biología Molecular Data: 2017.
• Tomás García-Caballero(2009)Hibridación in situ, BASES MOLECULARES DEL CÁNCER, Xàtiva.
• AGRAWL, S., C. Christodoulow, M.J. Gait. 1969. Efficient methods for attaching nonradioactive labesl
to the 5’-ends of synthetic oligodeoxyribonucleotides. Nuclei Acids Res. 14, 6227-6245.
• BASAGRA, O., T. Seshamma, R. Pomerantz. 1993. Polymerase chain reaction in situ: intracelular
amplification and detection of HIV-1 proviral DNA and other especific genes. J. Immunol. Methods
158, 131-145