Procesos de

Bioseparación

Ing. Mario Vela Hipólito

 Unidad 2:
Síntesis del
bioproceso

2.5 Purificación
2.5.1 Introducción

 Una vez que los caldos biológicos han sido concentrados el paso
siguiente dentro de un esquema general de separación, es la
purificación del producto de interés.
2.5.2 Cromatografía por elución

 La mayoría de los bioprocesos involucran al menos una

operación cromatográfica que frecuentemente es la clave para la
factibilidad técnica del proceso de separación.

 Aunado a que es una operación relativamente cara, se debe tener

un especial cuidado en su escalamiento.
 La cromatografía por elución es un método para separar
en sus componentes (resolver) una mezcla de solutos y es
empleada con el propósito de purificar productos de
interés.

 Ésta se efectúa en columnas empacadas con

adsorbentes que pueden ser sólidos, sólidos porosos o
geles. El adsorbente constituye la fase estacionaria de la
columna.
 En la operación de una columna cromatográfica se
aplica una pequeña cantidad de muestra en la parte
superior de la columna.

 Una vez colocada la mezcla se ha pasar un líquido que

favorezca la desorción llamada eluyente (fase móvil).
Conforme avanzan los solutos sobre la columna éstos se
separan permitiendo su purificación.
 En la cromatografía por elusión isocrática, la composición
del eluyente se mantiene constante durante el proceso. En
la elución por gradiente la composición del eluyente se
varía gradualmente.
La operación de una columna cromatográfica es similar a
la de una columna de adsorción. Sin embargo, en la
cromatografía por elución la columna no se satura
completamente con soluto, sino que sólo se carga en
forma controlada una porción de ésta.
 La decisión entre emplear adsorción o cromatografía por
elución en una separación, radica principalmente en la
dilución del soluto.

 Por ejemplo, si se desea remover de una solución acuosa

diluida dos compuestos orgánicos A y B muy similares, la
operación apropiada es una adsorción frontal.
 Por otro lado, si estos mismos compuestos se desean
separar entre sí con una alta pureza a partir de una
muestra concentrada, la selección apropiada es la
cromatografía por elución.
 En la figura, se representa la separación cromatográfica
de una mezcla de tres solutos.

 Cada soluto tiene diferente grado de retención en la

columna de tal manera que la velocidad de avance de
cada uno es diferente, siendo el soluto A (círculo) el más
lento y el soluto C (triángulo) el más rápido.
 Un detector de
solutos a la salida de
la columna obtendría
una gráfica llamada
cromatograma.
 En la cromatografía por elución el soluto se purifica a
expensas de cierto grado de dilución, mientras que en la
adsorción frontal el soluto se retiene en la columna y
posteriormente se eluye concentrado.
 Existen varias técnicas cromatográficas basadas en la
interacción de una fase móvil líquida y una fase
estacionaria.
 Cinco aspectos fundamentales permiten distinguir las
semejanzas y diferencias entre ellas:
 El principio de separación que emplea cada una de ellas

 Las características de las matrices que utilizan

 La presión a la que se operan

 La relación de equilibrio del sistema cromatográfico

 La cinética de la adsorción
2.5.2.1 Tipos de cromatografía líquida

 De acuerdo al principio utilizado para la separación se pueden

distinguir tres tipos básicos de cromatografía:
 Cromatografía líquido - líquido

 Cromatografía de filtración en gel o por exclusión por tamaño

 Cromatografía por adsorción

Cromatografía líquido-líquido

 En la cromatografía líquido-líquido se utiliza un adsorbente sólido

impregnado con un líquido que funciona como fase estacionaria.

 La separación de los solutos es resultado de las diferencias en los

coeficientes de partición de cada uno de los solutos de la mezcla
entre las fases.
Cromatografía por filtración en gel

 La cromatografía por filtración en gel utiliza partículas fabricadas

de geles porosas que actúan como mallas moleculares que
permiten separar moléculas en función de su tamaño.

 Este tipo de cromatografía es comúnmente empleada en las

últimas etapas de los procesos de obtención de productos.
Cromatografía por adsorción

 La cromatografía por adsorción emplea adsorbentes en los que

los solutos a separar presentan diferentes grados de retención.

 Existen varias modalidades caracterizadas por el tipo de

adsorbente que emplean:
 La cromatografía por adsorción simple se caracteriza por
la unión del soluto al adsorbente por fuerzas débiles del tipo
de van Der Waals.

 Este tipo de cromatografía es poco selectiva entonces se

utiliza poco a nivel analítico, pero por su bajo costo es
utilizada a nivel industrial.
 La cromatografía por intercambio iónico se basa en la
interacción electrostática entre los grupos cargados del
soluto y los grupos de carga contraria de los adsorbentes.
 La cromatografía de interacción hidrofóbica y
cromatografía de fase reversa, se basan en la interacción
entre las regiones hidrofóbicas de las biomoléculas y los
grupos hidrofóbicos de los adsorbentes empleados
 La cromatografía por afinidad está basada en
interacciones altamente específicas entre el soluto de
interés y el adsorbente.

 Este tipo de cromatografía es muy empleada en la

purificación de proteínas. Los adsorbentes utilizados en esta
cromatografía presentan grupos químicos llamados
ligandos que son altamente específicos para la unión con
los solutos.
2.5.2.2 Matrices

 Actualmente diversos tipos de materiales o matrices son

utilizados para fabricar los soportes (empaques) de las columnas
cromatográficas. En algunos casos estos materiales se modifican
químicamente para incrementar su especificidad.
 Alrededor del 90 % de las matrices que se emplean
actualmente están hechas de materiales que forman geles
de alto poder hidratante, los cuales se comercializan en
forma de pequeñas esferas.
 a) Celulosa (𝛽 1 − 4), b) Dextrano (𝛼 1 − 6), c) Agarosa y d)
Poliacrilamida entrecruzada
 En general los materiales de las matrices pueden ser de
cuatro tipos:
 Materiales inorgánicos: sílica porosa, vidrio de poro controlado

 Polímeros orgánicos sintéticos: poliacrilamida, polimetacrilato

 Polisacáridos: celulosa, dextrano y agarosa

 Compuestos polímeros orgánicos con polisacáridos

 Desde el punto de vista funcional se pueden distinguir dos
tipos de geles: microporosos y macroporosos.

 Los microporosos se obtienen por entrecruzamiento

puntual de polímeros lineales como celulosa, dextrano y la
poliacrilamida. Este tipo de geles son utilizados en
cromatografía de filtración en gel y tienen baja resistencia
mecánica.
 Los geles macroporosos se obtienen por entrecruzamiento
y agregación de polímeros, como la agarosa y la
poliacrilamida macromolecular. Este tipo de geles son
empleados en cromatografía de intercambio iónico y de
afinidad donde se requieren poros más grandes.
 De acuerdo a su comportamiento con relación al
disolvente, se pueden distinguir dos tipos de geles:
xerogeles y aerogeles. Los xerogeles se caracterizan por
arrugarse e hincharse en la ausencia y presencia del
disolvente.

 Por otro lado, el volumen de los aerogeles es

independiente del disolvente.
 Unidad 2:
Síntesis del
bioproceso

2.5.2 Precipitación
 La precipitación es el proceso en el que un soluto soluble
se separa en forma de sólido insoluble de una solución
mediante la acción de un agente precipitante.

 Algunos productos biotecnológicos presentan

solubilidades que varían con la temperatura, el pH, la
fuerza iónica y con la constante dieléctrica del medio.
 Esta propiedad puede ser utilizada para concentrar y
purificar estos productos mediante la operación de
precipitación. A nivel industrial puede ser utilizada para la
obtención de productos proteicos y nucleicos.
 Teóricamente la precipitación debe producir un soluto
concentrado y relativamente puro, por lo que es una
operación que se usa con frecuencia al inicio de un
proceso de bioseparación.

 Los agentes precipitantes seleccionados no deben

producir la desnaturalización del soluto.
 Las ventajas de usar la precipitación para la
concentración y purificación de solutos son:
 Es relativamente barata

 Es una operación que se adapta fácilmente a gran escala

 Puede realizarse de forma continua

 El equipo que se utiliza es sencillo

 Hay gran cantidad de agentes precipitantes baratos

 La precipitación de proteínas puede realizarse
empleando diferentes principios:
 Disminución de la solubilidad

 Desnaturalización selectiva

 Afinidad
 La precipitación por disminución de la solubilidad de la
proteína de interés se efectua por medio de un agente
precipitante. Este puede ser una sal neutra como el sulfato
de amonio; un agente que altere el pH de la solución, un
solvente orgánico o algún polímero.
Precipitación por disminución de la
solubilidad

 El hecho de que las proteínas sean moléculas anfotéricas se debe

a que sus superficies presentan regiones hidrofóbicas y regiones
hidrofílicas cargadas positiva o negativamente.
 Debido a su naturaleza
anfotérica, cuando una proteína
se encuentra en solución acuosa
produce complejas interacciones
con la disolución que la rodea.
 Particularmente, cuando se agrega un agente
precipitante a la disolución, las proteínas que presentan
mayor hidrofobicidad (por contar con mayor cantidad de
aminoácidos hidrofóbicos en su superficie) precipitan más
fácilmente que las de menor hidrofobicidad.
 La proteína permanece en solución cuando
termodinámicamente es más favorable estar rodeada por
el solvente que estar en un agregado con otra proteína
formando una fase sólida.

 La proteína puede insolubilizarse ya sea cambiando las

características de su superficie, o cambiando el solvente
que la rodea.
Precipitación con sales

 Una de las técnicas más ampliamente utilizadas para la

purificación de enzimas es la llamada precipitación por
insolubilización por salado, que se realiza agregando altas
concentraciones de sal a la solución en la que se encuentra la
proteína para producir su precipitación.
 Se puede graficar una
curva de solubilidad de
una proteína como una
función de la
concentración de la sal.
 Se observan dos regiones, la del lado izquierdo la
solubilidad de la proteína se incrementa con la
concentración de la sal, llamada región de solubilización
por salado, y la otra donde la solubilidad de la proteína
disminuye a medida que la concentración de la sal
aumenta, llamada región de insolubilización por salado o
“salting out”
 La descripción simplificada está basada en el hecho de
que la adición de las sales elimina el agua de la proteína
hidratada, dejando las regiones hidrofóbicas en libertad de
combinarse intermolecularmente.
Precipitación por desnaturalización
selectiva

 Si la proteína que se desea purificar presenta estabilidad en

condiciones extremas de temperatura, pH, o en disolvente orgánicos,
puede utilizarse esta propiedad en las primeras etapas del procesos de
purificación sujetando a la disolución de proteínas a estas condiciones
extremas, de tal manera que se eliminen por desnaturalización las
proteínas contaminantes.
Desnaturalización

 Cuando la proteína no ha sufrido ningún cambio en su interacción con

el disolvente, se dice que presenta una estructura nativa. Se llama
desnaturalización de las proteínas a la pérdida de las estructuras de
orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena
polipeptídica reducida a un polímero estadístico sin ninguna estructura
tridimensional fija.
 El objetivo de la desnaturalización selectiva es crear las
condiciones en las cuales la proteína de interés no se
desnaturaliza o su desnaturalización es mínima. Esto ya sea
mediante:
 Cambios en la temperatura

 Por pH

Por la adición de disolventes orgánicos

Precipitación por afinidad

 La precipitación de proteínas por afinidad se basa en la capacidad

que tienen las proteínas para unirse con ligandos por medio de sus
sitios activos.
 Es necesario que el ligando propicie un estado de
agregación de los complejos ligando-proteína. La
precipitación sólo ocurre cuando el ligando se une con las
proteínas o enzimas y forma agregados.
Equipo de precipitación

 La operación de precipitación puede realizarse en reactores con

las configuraciones por lotes, tubulares, continuos tipo tanque
agitado y continuos compartimentalizados.