Electroforesis SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulphate-

PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
ELECTROFORESIS: Método analítico que permite
separar moléculas biológicas, en función de su
carga, en un campo eléctrico
 APLICACIONES DE LA
ELECTROFORESIS SDS-PAGE
Grado de pureza de una proteína.
· Determinación de masa molecular.
· Verificación de la concentración de proteínas.
· Detección de proteólisis.
· Identificación de proteínas inmunoprecipitadas.
· Separación de proteínas marcadas con isótopos
radioactivos.
ELECTROFORESIS SDS-PAGE
SDS : dodecil sulfato de sodio
DETERGENTE ANIÓNICO

En la electroforesis SDS-PAGE el SDS se

agrega en TODO!!!!

1. En el gel
2. En el buffer de muestra
3. En el buffer de corrida
 Electroforesis SDS-PAGE
REACTIVOS UTILIZADOS
Para hacer la matriz (el gel)

N,Nʼ-metilen-bis-acrilamida Tetrametiletilendiamino (TEMED)

Acrilamida

Persulfato de amonio
¿Cómo se forma la matriz (el gel)?
MATRIZ DE POLIACRILAMIDA

Fase líquida o un gel Gel de

muy poroso poliacrilamida
Acrilamida
Químicamente inerte

Estable en un amplio rango de pH,

temperatura y fuerza iónica

Insoluble en agua

La matriz (el gel) se puede preparar

de forma rápida y reproducible

Se puede variar la concentración de

acrilamida y bisacrilamida para
modificar de manera controlada el
tamaño del poro: MAYOR
RESOLUCIÓN
En esta técnica es posible modificar los porcentajes de
acrilamida para obtener una mayor resolución

% de Acrilamida Rango de
separación
(tamaño)
15% 15 – 45 kDa
12.5% 15 – 60 kDa
10% 18 – 75 kDa
7.5 % 30 – 120 kDa
5% 60 – 212 kDa
ELECTROFORESIS SDS-PAGE
GELES CONCENTRADOR Y SEPARADOR
Diferente pH
Diferente % de Acrilamida

GEL CONCENTRADOR
Más poroso (2-5% acrilamida)
pH 6.8 Tris-HCl
SDS

GEL SEPARADOR
Menos poroso (7-15% acrilamida)
pH 8.8 Tris-HCl
SDS

El buffer de corrida
Tris/Glicina/SDS
 Se utilizan dos amortiguadores:
El buffer de corrida y el buffer de muestra

El Buffer de corrida contiene

1. SDS
2. Tris-HCl
3. Glicina
 Se utilizan dos amortiguadores:
El buffer de corrida y el buffer de muestra

El Buffer de muestra contiene

1. Beta mercaptoetanol
2. Azul de bromofenol
3. Glicerol
¿Cómo se consigue el efecto concentrador?
¿Cómo vamos a visualizar las proteínas

Marcadores de Peso
Molecular preteñidos

Frente de corrida
Los geles se pueden teñir con:

Azul de Comassie Plata (nitrato de plata)

 ¿Cómo vamos a determinar el tamaño
aproximado de las bandas obtenidas?
Con los estándares de peso molecular: obtenemos el RF
¿Cómo vamos a determinar el tamaño
aproximado de las bandas obtenidas?

Distancia total

Frente de
corrida
Elaboramos una gráfica con los datos obtenidos
de los estándares de peso molecular
Gel obtenido por SDS-PAGE que muestra el
progreso de una purificación exitosa
 Procedimiento de proteína
recombinante
• Tomar 2.5 mL de precultivo de E. coli transformado con
vector, añadir a 15 mL de LB
• Incubar con agitación a 37 ͦ C hasta OD600 0.6-0.8
• Tomar T0 (1 mL) e inducir con IPTG 1 mM (final)
• Seguir incubando y tomar alícuotas (1 mL) cada 30 min
por 2 h.
• Tomar 15 µL y mezclar con 10 µL de BC, desnaturalizar y
correr en SDS-PAGE.
 Peculiaridades de la
construcción:
• En el vector pET-TEM se insertaron los genes que
codifican para dos proteínas:
• 1) β-lactamasa
• 2) OmpA Proteína de tránsito que se inserta en
la membrana externa de las bacterias. (Pag. 43
del manual)
• Por lo tanto: no se requiere la extracción de la β-
lactamasa, esta será secretada al medio tras su
síntesis
Purificación de la proteína
recombinante
Proteina GFP
Purificación de la proteína recombinante
RESULTADOS DEL ALGÚN SEMESTRE EN EL
PASADO….

2h 1.5 h 1h 0
Después de la inducción