UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS

DEPARTAMENTO CIENCIAS DE LA VIDA

CARRERA DE INGENIERÍA AGROPECUARIA
SANTO DOMINGO

PERÍODO : Octubre 2016 - Febrero 2017

ASIGNATURA : Poscosecha.
ESTUDIANTE : Cinthya Vera.
NIVEL : Séptimo
DOCENTE : Ph. D. Juan Neira
Autores: Chen Huana , Li Jianga , Xiujuan Ana , Ruoyi
Kanga , Mingliang Yub , Ruijuan Mab , Zhifang Yua, 2014.
 RESUMEN
Las glutatión peroxidasas (GPXs) son miembros centrales en el sistema
antioxidante y juegan un papel importante en respuesta al estrés
oxidante.

Ocho genes de glutatión peroxidasa (PpaGPX1-8) fueron aislados de las

bases de datos del genoma en frutos de durazno y se caracterizó
mediante el análisis de bioinformática.

Los patrones de expresión de los genes GPX se analizaron en frutos de

durazno cosechados en tres clases de madurez diferentes y tratados con
calor + 1-MCP (HM).

Se encontró que los frutos no maduros tenían una mayor capacidad

enzimática como transcripcional en comparación con la fruta más
madura, y la fruta madura era más sensible al tratamiento con HM.
El tratamiento con HM retrasó dramáticamente el proceso de
maduración postcosecha de la fruta de durazno, posponiendo el pico
climático en la respiración, aumentando la firmeza, aumentando la
actividad de GPX y aumentando la expresión de PpaGPXs.
 INTRODUCCIÓN.
• El tratamiento con HM (el calor combinado con el tratamiento con 1-
metilciclopropeno (1-MCP)) es un nuevo método que puede retrasar
la maduración de la fruta y mantener su calidad sin toxicidad ni daño.
• Se ha demostrado que el tratamiento térmico es una tecnología
postcosecha eficiente que preserva la calidad organoléptica, reduce el
nivel de patógenos, reduce la lesión por enfriamiento y retrasa el
proceso de maduración y senescencia.
• 1-MCP se ha utilizado para retrasar dramáticamente la maduración,
mantener la calidad y prolongar la vida útil de los cultivos de frutas,
hortalizas y ornamentales. Sin embargo, se ha encontrado que el
tratamiento combinado de calor y 1-MCP puede tener un mejor
efecto.
• En el presente estudio, se utilizaron frutos de durazno como material
experimental que presenta una fisiología de maduración climatérica.
• Los genes GPX fueron identificados y analizados, utilizando la
secuencia de transcripción de las bases de datos de RDA y
Phytozome.
• Se investigaron los patrones de expresión de la familia de genes
PpaGPX tanto en el fruto de durazno tratado (HM) como en el no
tratado (CK) para caracterizar las funciones potenciales de GPX en la
regulación transcripcional durante la maduración del durazno.
 MATERIALES Y MÉTODOS
 Materiales y tratamientos de frutas.
Los ensayos se realizaron con frutos de durazno (Prunus persica L. cv. Xiahui ).

Cultivados en la huerta de
la Academia de Ciencias
Agrícolas de Jiangsu, en
Nanjing, provincia de
Jiangsu, China
• Aproximadamente mil frutas, de tamaño uniforme, libres de enfermedad, sin daño mecánico fueron
recolectadas.
• Las frutas se dividieron en tres clases de madurez: fruta verde (dura y verde), fruta medio madura (roja
y firme) y fruta madura (roja y blanda).
• Cada clase fue subdividida aleatoriamente en un grupo tratado (HM) y un grupo control (CK). El grupo
HM se trató con agua caliente a 48ºC durante 10 min y luego con 10 ml de 1 - MCP durante 12 h.
• Después de 30 minutos de ventilación, la fruta de durazno se almacenó a temperatura ambiente (20-
25ºC) con 80-90% de humedad relativa.
• Al día 1, día 3 y día 5 de almacenamiento, se tomaron 30 muestras de fruta respectivamente para
ensayo en tres repeticiones de 10 frutos. El grupo CK se almacenó en las mismas condiciones descritas
anteriormente sin ningún tratamiento el día 0, el día 1, el día 3 y el día 5.
  Identificación y análisis de genes PpaGPX.
Para identificar a los miembros de la familia de genes GPX en la fruta de durazno, se realizó una
búsqueda de palabras clave utilizando "glutatión peroxidasa" tanto de la base de datos
genómica para rosáceas (RDA) como del fitozoma (http: //www.phytozome.net/).

Se obtuvieron nueve y seis secuencias de las dos bases de datos; respectivamente; Y las
secuencias redundantes se tamizaron y descartaron. En adición; El dominio GSHPx en el resto
de las proteínas GPX putativo se localizó mediante el programa en línea SMART
(http://smart.embl-heidelberg.de/).

Finalmente; Ocho secuencias de proteínas se identificaron para su posterior análisis. Los genes
GPX putativos se denominaron PpaGPX1-PpaGPX8.
El peso molecular (kDa) y el punto isoeléctrico (PI) de cada proteína se calcularon mediante el
programa online ExPASy (http: // www. Expasy.org/tools/).
La alineación de múltiples secuencias de los GPXs de frutos de melocotón se llevó a cabo
utilizando el programa ClustalW con los parámetros por defecto, y los motivos se resaltaron
mediante el programa DNAMAN.
Un árbol filogenético se construyó utilizando MEGA (versión 6.0)
  Evaluación de la maduración de los frutos.

• Para evaluar la maduración del fruto, se midieron la frecuencia

respiratoria de la fruta, la firmeza y el contenido de sólidos solubles (SSC).
En esta medición se realizaron tres replicaciones biológicas
independientes y se utilizaron diez frutos en cada repetición.
• Se trató a cinco frutos en un envase hermético como unidad experimental
y se obtuvieron seis repeticiones de un total de 30 frutos (de las 3
repeticiones de 10 frutos).
• Después de 15 min de equilibrado en el recipiente, se midió la velocidad
de respiración en base a la cantidad de CO2 liberado, usando un
analizador portátil de CO2 infrarrojo.
• Los resultados se expresaron como CO2mg kg1 s1.
• La firmeza de la fruta se midió en el ecuador de la fruta usando un
analizador de textura equipado con una sonda plana (8,0 mm). Dos
medidas (expresadas en Newton (N)) se hicieron en los lados opuestos de
cada fruta después de la eliminación de una rebanada de piel de 1 mm de
espesor. El contenido de sólidos solubles (expresado en porcentaje) se
determinó con un refractómetro digital midiendo el índice de refracción
del jugo extraído de la misma fruta que se había utilizado para determinar
la firmeza.
• Después de la determinación de la respiración, la firmeza y el SSC, se
recogió la pulpa de las mismas muestras y se congeló inmediatamente en
nitrógeno líquido y se almacenó a 80ºC hasta análisis bioquímico.
  Ensayos de actividad enzimática

La actividad de la glutatión peroxidasa (GPX) se midió por un método

espectrofotométrico según Drotar, 1985 con ligera modificación utilizando
un lector de microplacas.
La actividad enzimática se expresó como las unidades (U) por kilogramo de
proteína, y una unidad se definió como una disminución de A340 en un
minuto. Las proteínas solubles totales del extracto enzimático se
determinaron por el método descrito por Bradford (Bradford, 1976) usando
albúmina de suero bovino como estándar.
 Análisis de aislamiento y expresión de ARN

El ARN total se aisló de la fruta de durazno usando el Kit de Extracción de

ARN de la Planta MiniBEST. Las muestras de ARN se trataron con DNasa
libre de ARNasa,para eliminar trazas de ADN genómico.

Todos los experimentos se realizaron por triplicado con idénticas

condiciones de ciclos térmicos, que consistían en una desnaturalización
inicial a 95ºC durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 95ºC durante 3 s y
60ºC durante 1 min.
Se verificó la contaminación potencial del ADN genómico con control
negativo reversible.
  Análisis estadístico.

Los experimentos se realizaron como un diseño completamente al

azar.
Cada punto de tiempo de muestreo para cada tratamiento estaba
compuesto de tres repeticiones biológicas independientes. Los
errores estándar (SE) fueron calculados por Microsoft Excel, y las
cifras se hicieron con Origin Pro 7.5G .
Las cifras revelaron diferencias entre tratamientos experimentales
basados ​en los resultados de una prueba LSD (p = 0,05) a través del
software SPSS 18.0.
 RESULTADOS
 Identificación y análisis de secuencias de los miembros de la
familia del gen GPX del durazno.

Los ocho PpaGPXs se mapearon principalmente en

tres cromosomas, cinco en Chr 5, dos en Chr 1 y
sólo uno en Chr 8. Cuatro tipos de proteínas se
diferenciaron en función de su localización
subcelular. PpaGPX4, PpaGPX5, PpaGPX7 y
PpaGPX8 se localizaron en el citosol.
Los resultados de la
alineación de secuencias
múltiples revelaron que las
ocho proteínas PpaGPX
contenían los tres motivos
conservados (I, II, III), con un
residuo Cys típico en cada
motivo (Cys-119, Cys-148,
Cys167). Otros tres residuos
(Gly-120, Gln-150, Trp-210),
denotados con asteriscos,
estuvieron involucrados en
el mecanismo catalítico de
los seleno-GPXs de
mamíferos, que también se
conservaron en melocotón.
La identidad de secuencia de
aminoácidos deducida entre
PpaGPX1-8 varió de 52% a
94%, y PpaGPX5 y PpaGPX7
compartieron grados más
altos de identidad (94% y
87%, respectivamente) con
la proteína primaria
PpaGPX8.
Para el análisis filogenético, se construyó un árbol filogenético sin raíces
utilizando la mayoría de las secuencias GPX de plantas presentes en las
bases de datos basadas principalmente en las ocho y seis GPX identificadas
en los genomas de Arabidopsis y Populus, respectivamente.

Los resultados indicaron que GPXs de fruta de durazno mostraron

estructura secuencial específica y características funcionales y motivos
altamente conservados, y podrían desempeñar papeles similares a los de
otros factores de transcripción GPX en plantas.
 Efecto de tratamientos sobre atributos de calidad y actividad
GPX.
Estos resultados sugieren que el tratamiento con HM retrasó dramáticamente el pico
climático en la respiración, la firmeza mejorada y el aumento de la actividad de GPX en la
fruta de melocotón de las clases más maduras.
  Expresión de genes PpaGPX en frutos de durazno de tres clases
de madurez.
Niveles de expresión de los ocho genes PpaGPX dentro de cada clase PpaGPX6 y PpaGPX8 fueron las más
de madurez.
expresadas en las tres clases de
madurez. En comparación con
PpaGPX1, la expresión de PpaGPX6 fue
13 veces mayor en la fruta inmadura,
12 veces más alta en la fruta mitad
madura y 8 veces más alta en la fruta
madura.

Expresión de un miembro específico de los genes PpaGPX entre las

tres clases de madurez.
La expresión de PpaGPX3 fue alta tanto
en la mitad de madura (3,5 veces) y la
fruta madura (4,2 veces), y la de
PpaGPX4 fue alta en la mitad de la fruta
madura (2,2 veces) . Sin embargo, las
expresiones de PpaGPX1 / 5/6/7/8
fueron similares o bajas tanto en la
fruta mitad madura y la fruta madura.

Los resultados indicaron que PpaGPX6 y PpaGPX8 fueron altamente

expresado genes durante la maduración de los frutos de melocotón y frutas
no maduras tenían un mayor nivel de transcripción en comparación con
más madura fruta.
 Expresión de genes PpaGPX en frutos de melocotón bajo tratamiento HM.

Estos resultados
mostraron que PpaGPXs
tenía funciones
reguladoras en la última
etapa de la maduración
del durazno.
 Análisis de las secuencias promotoras de los genes PpaGPX

Se realizó un análisis promotor en la secuencia de 1000 pb aguas

arriba del sitio de inicio de la traducción para cada uno de los ocho
genes PpaGPX usando PlantCARE.

Estos resultados concluyen que el estrés abiótico de HM no fue la

principal razón para la regulación de hasta el nivel transcripcional de los
genes PpaGPX.
 CONCLUSIONES.
 Se identificaron ocho genes GPX (PpaGPX1-8) en fruta de
melocotón basándose en su homología de secuencia génica de las
bases de datos del genoma.
 En el fruto de durazno de diferentes clases de madurez, PpaGPX6 y
PpaGPX8 fueron los más expresados ​PpaGPX genes y PpaGPX3 fue
el menos expresado.
 La actividad enzimática y la expresión de PpaGPXs fueron las más
altas en la fruta inmadura.
 PpaGPX genes no mostraron cambios significativos en la expresión
tanto en la CK y HM grupos en la etapa temprana de maduración,
pero la expresión de todos estos genes (excepto PpaGPX1) fue
significativamente regulado en la última etapa de maduración.
 El tratamiento con HM retrasó dramáticamente la maduración de
la fruta de melocotón poscosecha, posponiendo el pico climático
en la respiración, aumentando la actividad de GPX y aumentando la
expresión de PpaGPXs. GPXs mostraron su función reguladora en la
última etapa de la maduración del durazno.