Origen

A principios del siglo XX, el botánico

ruso Tswett separó pigmentos vegetales
pasando soluciones de estos pigmentos
por una columna de vidrio
empaquetada con CaCO3. Las especies
separadas aparecían como bandas de
colores, lo que dio origen al nombre del
método

chroma = color graphé = escribir

 Un sistema cromatográfico consta de dos fases

Fase móvil (líquida o gaseosa): contiene los

componentes a separar y fluye a través de la fase
estacionaria

Fase estacionaria (líquida o sólida): a través de la

cual fluye la fase móvil y donde quedan
momentáneamente retenidos los componentes de la
muestra
Definición

Cromatografía: técnica separativa donde los

componentes de una muestra se distribuyen
entre dos fases (FM y FE), como consecuencia
de su diferente afinidad hacia dichas fases. La
separación se basa en las distintas velocidades
de migración de los analitos, determinadas por
el tiempo que permanecen en cada fase
 Clasificación
FM FE Método Interacción
líquida L-L y L-FL partición L-L
sólida L-S adsorción
Líquida resina i.i. intercambio iónico
Inter. Iónico
(cromatografía gel poroso
líquida) otras exclusión tamizado

afinidad reacción
líquida específica
sólida
Gaseosa G-L y G-FL partición G-L
(cromatografía
gaseosa) G-S adsorción

Fluido supercrítico (cromatografía de fluidos supercríticos)

 Clasificación
De acuerdo a la disposición física de la FE
Planar Columna

papel

capa
delgada
 Cromatografía en columna: elución
Muestra FM FM FM FM

A+B

B
A
B
A
B
A Detector
B
t0 t1 t2 t3 t4
Análisis cualitativo y
cuantitativo
Objetivo de la cromatografía

resolver los componentes de una muestra

Cromatograma con
picos no resueltos

Mejora por aumento en

la separación de bandas

Mejora por disminución

del ancho de bandas
 Distribución de A y B dentro de la columna
t1
Concentración (CE)
t2
t3
B A B A

Distancia de migración (L)

El ensanchamiento de cada banda se produce a una
velocidad menor que su desplazamiento → se logran
separaciones exitosas
 Teorías del proceso cromatográfico

La teoría del proceso cromatográfico debe explicar las

variables que influyen en la velocidad de migración de
los analitos y en el ensanchamiento de las bandas

Teoría de los platos: concepto de N y H (similitud con

columna de destilación fraccionada). Explica la forma
gaussiana de las bandas pero no su ensanchamiento
durante el proceso cromatográfico.
Teoría cinética: La columna opera en situación de no-
equilibrio. Nuevo concepto de N y H
 Cromatograma

tŔ
SEÑAL DETECTOR tR

tM

compuesto analito TIEMPO

no retenido
por FE
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

La cromatografía es una técnica que permite la

separación de los componentes de una mezcla
debido a la influencia de dos efectos contrapuestos.
• a) Retención. Efecto producido sobre los
componentes de la mezcla por una fase
estacionaria, que puede ser un sólido o un
líquido anclado a un soporte sólido.
• b) Desplazamiento. Efecto ejercido sobre los
componentes de la mezcla por una fase móvil,
que puede ser un líquido o un gas.
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA
Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la
fase móvil se pueden distinguir distintos tipos de
cromatografía
 a) Cromatografía sólido-líquido. La fase estacionaria es un
sólido y la móvil un líquido.
 b) Cromatografía líquido-líquido. La fase estacionaria es un
líquido anclado a un soporte sólido.
 c) Cromatografía líquido-gas. La fase estacionaria es un
líquido no volátil impregnado en un sólido y la fase móvil es
un gas.
 d) Cromatografía sólido-gas. La fase estacionaria es un
sólido y la móvil un gas.
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
 Según el tipo de interacción que se establece entre los
componentes de la mezcla y la fase móvil y estacionaria
podemos distinguir entre.

 a) Cromatografía de adsorción. La fase estacionaria es un

sólido polar capaz de adsorber a los componentes de la
mezcla mediante interacciones de tipo polar.
 b) Cromatografía de partición. La separación se basa en las
diferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla
en las fases estacionaria y móvil, que son ambas líquidas.
 c) Cromatografía de intercambio iónico. La fase estacionaria
es un sólido que lleva anclados grupos funcionales
ionizables cuya carga se puede intercambiar por aquellos
iones presentes en la fase móvil.
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
CROMATOGRAFÍA GASEOSA
En cromatografía de gases (GC), la muestra se
volatiliza y se inyecta en la cabeza de una
columna cromatográfica. La elución se produce
por el flujo de una fase móvil de un gas inerte, y
a diferencia de la mayoría de los tipos de
cromatografía, la fase móvil no interacciona con
las moléculas del analito; su única función es la
de transportar el analito a través de la columna.
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
DESCRIPCIÓN DEL EQUIPO
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
CROMATOGRAFO GASEOSO
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Sistema de introducción de muestra:
Los dispositivos de inyección de muestra tienen la función de
vaporizar la muestra a analizar e incorporarla a la corriente del
gas transportador que se dirige hacia la columna.
La vaporización e introducción de la muestra al sistema, debe
realizarse cumpliendo una serie de requisitos:
 La vaporización de la muestra debe ser rápida
 La vaporización Debe realizarse sin discriminar ningún
componente de la muestra.
 La muestra debe llegar a la columna como una banda lo más
fina posible.
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
ESQUEMA DE INYECTOR
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
COLUMNA CROMATOGRAFICA:
Está formada por un tubo, que puede ser de
diversos materiales, dentro del cual se
encuentra la fase estacionaria que puede ser un
sólido activo (cromatografía gas sólido) o un
líquido depositado sobre las partículas de un
solido portador (columnas empaquetadas) o
sobre las propias paredes del tubo (columnas
tubulares abiertas)
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
DETECTORES:
Los detectores utilizados en CG son del tipo
diferencial: no ofrecen señal cuando pasa por
ellos solamente el gas portador y responden
ante alguna propiedad que puede variar cuando
éste se encuentra mezclado con alguna
sustancia eluida de la columna.
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
PARAMETROS CARACTERISTICOS DE UN DETECTOR (cont):
Mínima señal detectable:
 El valor de señal correspondiente a la mínima
cantidad detectable podrá calcular en base al
valor del incremento de señal necesario (∆S) para
ser significativamente diferente del resto de la
distribución.
 Se puede calcular que una señal es
significativamente diferente del ruido, con un
95% de probabilidad, cuando su valor es dos
veces superior al intervalo de ruido.
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
DETECTORES: Clasificación
1. UNIVERSALES: Generan señal para cualquier
sustancia eluida.
2. SELECTIVOS: Detectan solamente sust. con
determinada propiedad fisicoquímica.
3. ESPECÍFICOS: detectan sustancias que
poseen determinado elemento o grupo
funcional en sus estructuras
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Tipos de detectores:
4 utilizados en la mayor parte de las
aplicaciones:
FID (Detector de Ionización en llama)
TCD (Detector de Conductividad Térmica)
ECD (Detector de Captura Electrónica)
MS (Detector Espectrométrico de Masas)
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Detector FID:
Es uno de los más empleados.
Forma una llama que quema y ioniza los
compuestos separados en la columna.
Insensible a grupos funcionales como C=O,
OH, NH que originan en la llama pocos iones.
Elevada sensibilidad (10-13 g soluto/mL).
Destructivo
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Detector TCD:
 Se basa en los cambios en la conductividad
térmica de la corriente de gas portador debido a
la presencia de moléculas del analito.
 Responde a la concentración del soluto en el gas
portador.
 No es destructivo.
 La conductividad térmica del gas portador ha de
ser elevada (He,H2 ) 6 a 10 veces mayor que la
mayoría de los comp. orgánicos.
 Baja sensibilidad (10 -8 g soluto/mL).
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Detector ECD:
Se basa en la captura de los electrones libres
´procedentes de la ionización del gas portador,
disminuyendo la intensidad de corriente.
El más sensible (10-14 g soluto/mL).
No destructivo.
Su aplicación principal es para compuestos
organoclorados (plaguicidas, herbicidas)
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFIA GASEOSA
Las aplicaciones más numerosas de la CG se
encuentran en el campo del análisis cualitativo y
cuantitativo de mezclas complejas de compuestos
orgánicos.
Aunque la cromatografía es básicamente un
método de separación, de cada cromatograma se
obtiene información cualitativa a partir de la
posición de los picos, y cuantitativa, a partir de la
medida de su altura o de su área.
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
• Aplicaciones
• Medioambientales: Análisis de pesticidas y herbicidas, análisis de
hidrocarburos, semivolátiles y volátiles, análisis del aire...
• Alimentos y aromas: fragancias y aromas, aceites, bebidas, ácidos
orgánicos, azúcares, ésteres metílicos, triglicéridos, alcoholes...
• Química Industrial: alcoholes, ácidos orgánicos, aminas,aldehídos y
cetonas, ésteres y glicoles, hidrocarburos, disolventes, anilinas,
gases inorgánicos...
• Biociencia: drogas, fármacos, alcoholes y contaminantes en sangre,
disolventes residuales...
• Derivados del petróleo: gas natural, gas de refinería, gasolinas,
gasóleos, parafinas...
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Aplicaciones de la cromatografía de gases
 La cromatografía de gases tiene amplia aplicación, en las
industrias se enfoca principalmente a evaluar la pureza de
los reactantes y productos de reacción o bien a monitorear
la secuencia de la reacción, para los fabricantes de
reactivos químicos su aplicación para la determinación de
la pureza es lo más importante.
 En la investigación es un auxiliar indispensable para
diversas técnicas de evaluación, entre las principales están
los estudios cinéticos, análisis de adsorción a temperatura
programada, determinación de áreas específicas por
adsorción de gas y determinación de isotermas de
adsorción.
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
DETERMINACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS EN UNA NUEVA ESPECIE
DE ALGA DEL GÉNERO NOSTOC
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA PRESIÓN:
Los componentes de una mezcla son llevados a
través de una fase estacionaria fijada dentro de
una columna mediante el flujo de una fase móvil
líquida. Las separaciones están basadas en las
diferencias de la velocidad de migración entre
los componentes de la muestra, que vienen
condicionadas por la naturaleza de los analitos y
su interacción con las fases.
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
DESCRIPCIÓN DEL EQUIPO
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
CROMATOGRAFO LIQ. DE ALTA RESOLUCIÓN
MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenómeno físico que provoca la separación, la
cromatografía liquida de alta resolución puede ser:
1. Cromatografía de adsorción.
La fase fija es un solido y se utiliza casi exclusivamente sílice (silica) y en mucha menor medida
alúmina.
2. Cromatografía de reparto.
En casi todos los casos, como fase estacionaria se utilizan compuestos unidos químicamente a
un soporte solido de silica. Se la subdivide en cromatografía en fase normal y fase reversa.
En la cromatografía en fase normal, la fase fija es polar (como por ejemplo agua o trietilenglicol) y
los compuestos menos polares eluyen primero.
En la cromatografía en fase reversa, el compuesto unido químicamente es un hidrocarburo
alifático y se emplean fases móviles polares. En este caso, las sustancias mas polares eluyen
primero.
3. Cromatografía iónica.
Se utilizan columnas rellenas con resinas de intercambio ionico para separar y determinar iones.
4. Cromatografía de exclusión por tamaño.
La fase fija esta formada por partículas poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de
poros y llevan a cabo un fraccionamiento relacionado con el tamaño molecular. Las moléculas de
tamaño mayor son excluidas y eluyen primero, mientras que las mas pequeñas que penetran en
los poros son retenidas mas tiempo.
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
DETECTORES:
 De conductividad electrolítica: el flujo pasa a través de un capilar con dos
electrodos, la conductividad varia en función de la composición del eluyente
y se miden. Muy común en combinación con el HPLC de intercambio iónico.
 Electroquímicos: se basa en la reacción de oxidación/reducción del analito
con un electrodo, el nivel de reacción es proporcional a la concentración de
analito, midiendo esto y comparándolo con el electrodo de referencia nos
da datos que podemos usar para cuantificar.
 De fluorescencia: permite hacer un análisis cualitativo, puesto que las
sustancias al ser excitadas con ciertas longitudes de onda, emiten en
longitudes de onda en el espectro ultravioleta únicas para cada sustancia.
 De índice de refracción: la detección implica la medida del cambio del índice
de refracción de la columna de eluyente. Se mide la diferencia entre el
índice de refracción de la fase móvil y la muestra.
 De luz visible/ultravioleta: el detector es básicamente un espectrofotómetro
que mide el cambio que sufre un haz luminoso al atravesar la muestra,
midiendo la absorbancia de las sustancias.
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
La HPLC permite muy buenas separaciones
e identificaciones de sustancias o grupos de sustancias en
un tiempo corto, tanto cualitativa como
cuantitativamente. Como condición, es imprescindible
que la muestra sea soluble en un disolvente al ser la fase
móvil un líquido. Es la técnica analítica de separación más
ampliamente utilizada debido a sus cualidades de
sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones
cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de
especies no volátiles o termolábiles y su gran
adaptabilidad a sustancias que son de gran interés para la
industria, la ciencia y la sociedad.
MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
CONTENIDO DE FLAVONOLES EN UVAS PARA VINO CULTIVADAS EN EL VALLE
DE CASABLANCA, CHILE