UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA DEPARTAMENTO

ACADEMICO DE CIENCIA Y TEC. DE ALIM. Y PROD. PESQ.

FACULTAD DE INGENIERÍA PESQUERA

CURSO : MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

 CULTIVOS

Es el desarrollo de bacterias
y otros Mos; en medios de
cultivo a nivel de laboratorio
 CULTIVOS

Es un método para la
multiplicación de Mos a nivel
de laboratorio
Además de conocer los nutrientes
apropiados para el cultivo de
Mos también conviene saber
las condiciones físicas donde
puedan desarrollarse mejor.

CONDICIONES PARA EL DESARROLLO

DE LOS MOS
Un buen cultivo necesita
Combinar apropiadamente
los nutrientes necesarios y las
condiciones físicas
Adecuadas.

CONDICIONES PARA EL DESARROLLO

DE LOS MOS
CONDICIONES FISICAS NECESARIAS PARA EL DESARROLLO

1.Temperatura:
El desarrollo de las bacterias
depende de la velocidad de las reacciones
químicas

La T° puede determinar la
velocidad de crecimiento y el grado
total de desarrollo de los M.O.
Las variaciones en la T° influye
en los procesos metabólicos y en
la morfología celular
CONDICIONES FISICAS NECESARIAS PARA EL DESARROLLO

Cada tipo de bacteria crece a cierta Tº

dentro de cierto límite de acuerdo
con esto las bacterias se dividen en :
1. Psicrófilas: capaces de desarrollarse a
0°C ó menos aunque crecen mejor a Tº
superiores a 0°cercano a 5° - 15°C.
2. Mesófilas Se desarrollan entre
los límites de T° 25 – 30°C
3. Termófilas: solo se desarrollan
en un rango entre 45° a 55°C.
CONDICIONES FISICAS NECESARIAS PARA EL DESARROLLO

Las bacteria termófilas pueden

ser :
Termófilos facultativos
si su crecimiento se extienden
a la región mesófila:.
Termófilas verdaderas o
termófilos obligados
o estenotermófilos Si solo crecen
en T° de 55°C y no se desarrollan
a T° de la región mesófila :.
CONDICIONES FISICAS NECESARIAS PARA EL DESARROLLO

Necesidades de gases soy Aerobio

Los gases que afectan
el desarrollo bacteriano
son el O2 y CO2.
¡uy Yo
noo!
Las bacterias presentan
una respuesta variable
al O2 libre por ello se
¡somos
dividen en : anaerobios !
 NECESIDADES DE GASES.
Aerobios
Aenaerobios Aerobios Microaerobios
obligado
obligados facultativos
s bacterias que
bacterias que bacterias que bacterias que se crecen en
se desarrollan se desarrollan desarrollan tanto presencia de
en presencia en ausencia de en presencia como pequeñísima
de O2. O2 libre. en ausencia de O2. s cantidades
de O2 libre.

Aerobios,
 (a) Los aerobios obligados crecen
solo en la superficie.

(b) Los anaerobios, son sensibles al

oxígeno, crecen en el fondo, lejos
de la superficie.
(a) (b)

(c) Los facultativos o aerotolerantes

crecen en Todo el tubo.

(d) Los microaerofílicos tienden

a crecer cercanos a la
superficie.
(c) (d)
 Obtención de microorganismos
aerobios en grandes cantidades.

incrementar el medio a la exposición de la atmósfera

Poner el medio de cultivo en capas poco profundas, para los
cuales existen recipientes adecuados:

matraces de botellas de Roux. matraces de

Fermback kolle
 Métodos de anaerobiosis se
pueden conseguir :
Las bacterias Agregando al medio de cultivo un
compuesto reductor. Ej: triglicolato de
anaeróbicas sodio, para disminuir el contenido de O2.
se podrán
Quitando al O2 por procedimientos
desarrollar si mecánicos expulsando el aire y bombeo
N2 y CO2.
se toman
precauciones Mediante reacciones químicas
especiales dentro del recipiente para que
de consuman el O2 libre Ej:
anaerobiosis: encender una vela para
transformar el O2 en CO2.
cámara de anaeribiosis:
Es una cámara con
atmosfera controlada
por medio de gases
especiales para el
cultivo de bacterias
anaerobias
 pH
La mayor parte de bacterias tienen un pH óptimo de
crecimiento entre 6.6 – 7.3, aunque algunas
bacterias puede desarrollarse a pH extremos 4 y 8.

El pH puede cambiar como

resultado de las sustancias
producidas por M.O. EJ:
ácidos o básicos.
 pH
El cambio de pH puede ser tan
notable que acabe por enturbiar
el medio, debido al pH .

Los cambios en el pH se pueden

prevenir mediante la
incorporación de un elemento
paliativo (Buffer) en el medio de
cultivo.
 Cultivos mixtos cultivos puros

cuando en un mismo
medio de cultivo se Representa las
desarrollan diferentes condiciones
tipos de bacterias artificiales para
que pueden tener
el desarrollo de
aspectos muy
diferentes, apariencia un solo tipo de
y características M.O.,
bioquímicas.
 cultivos puros
son importantes para conocer
las características específicas de
Cada especie

Para ello el mo
se debe aislar y
cultivar como
un cultivo puro.
 Técnica de siembra
en placa: Por estrías
Métodos y rayado
para aislar
cultivos Técnica de la
puros. placa vertida.

Técnica de
enriquecimient
o de cultivo.
 Técnica de siembra por estría en Placa y por
difusión en placa.
Técnica de siembra por estrías : se pasa una porción de la muestra
a la superficie de un medio de cultivo y se siembra por estrías o por
difusión.

segundo grupo Tercer grupo Cuarto grupo

una sola estría de estrías
de estrías de estrías

Para sembrar por rayado o método francés

consiste en hacer 5 líneas paralelas con la el inoculo
sobre la superficie del medio
Luego girar la placa y hacer 5 líneas arrastrando el
inoculo hasta completar la placa
Las células bacterianas quedan
superficialmente separadas en
algunas áreas de la placa.

Utilización de un asa de cultivo como método de

transferencia aséptica
Cada colonia aislada es descendencia de una
sola célula y por lo tanto un cultivo puro.

En las especies donde las células se

agrupan de manera característica,
(Staphilococus) también son un
cultivo puro.
 Consiste en diluir la muestra en
tubos con agar fundido

Las placas
El medio se
mantiene al estado El medio con se incuban
liquido
temperatura
a una
de
el inoculo en forma
homogenizado
45°C para permitir
se vierte
invertida
Inoculo que el inoculo se
distribuya en una placa
adecuadamente en
el medio.
petri
 Esta técnica se hace de forma cualitativa o
cuantitativa.
Cuando se hace de forma cuantitativa podremos
determinar el numero de MOS
 Si no se conoce la magnitud de la población bacteriana
de la muestra
Se necesita hacer diluciones en tubos para obtener
colonias bien aisladas
1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

9 ml
Agar
90 ml de SSP
Muestra 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-5
Agregar con una colonia estéril 1.0 ml o 0.1ml
Después de la
incubación se
examinan las placas
que tengan colonias
aisladas, para aislar 159 17 2 0
cultivos puros.. muchas colonias colonias colonias colonias colonias
mas de 300
se examinan las
placas para buscar
las que tengan
colonias aisladas, de
esta placa se
pueden aislar
cultivos puros..
 Muestra

10 ml

SSP
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
muestras
diluidas

0,1ml

10-1 10-2 10-3 10 -4 10-5

Incubación 31ºC, 72h

Recuento
¿Cuántas
pipetas estériles
deberé de
utilizar para
evitar
contaminación y
error?
 Cuenta en placa

• Consiste en contar
colonias que se
desarrollan después
de cierto tiempo
• presupone que cada
colonia proviene de
un microorganismo
en la muestra.
– Vertido
– Superficie
 Cuenta en placa

• Consiste en contar
colonias que se
desarrollan después
de cierto tiempo
• presupone que cada
colonia proviene de un
microorganismo en la
muestra.
– Vertido
– Superficie
Para separar bacterias esporuladas

Las esporas en general, resisten hasta

80º C por 10 minutos,
Las formas vegetativas mueren al ser
sometidas tT° de 60-70º C.

Este método se emplea para aislar bacterias

del género Clostridium (esporulados).
 Factores que afectan el recuento en
placa
1. Métodos de muestreo
2. Antecedentes del alimento previos al examen
3. Temperatura y tiempo de incubación
4. pH, aW y potencial de óxido reducción
5. Tipo de diluyente
6. Existencia de otros microorganismos
competidores o antagonistas
Técnicas de enriquecimiento de cultivo.

Los medios de enriquecimiento

se usan cuando:

El tipo de bacteria que queremos

aislar se encuentra en muy
pequeñas cantidades
Y es de desarrollo muy lento
que otras especies presentes
Técnicas de enriquecimiento de cultivo.

Supóngase que se quiera aislar del suelo

bacterias capaces de utilizar sustancias
químicas muy complejas como alfa –
conidendrina.(constituyente de la madera).

si se siembra en agar nutritivo directamente

una muestra del suelo estas bacterias
no crecen .
Técnicas de enriquecimiento de cultivo.

Para el crecimiento de la bacteria

alfa conidendrina
Se debe preparar un medio
líquido compuesto por: sales
inorgánicas como fuente N2
y alfa conidendrina como
fuente de carbono.
Técnicas de enriquecimiento de cultivo.

Las bacterias que no son

capaces de metabolizar
la alfaconidendrina
no crecerán.
Técnicas de enriquecimiento de cultivo.

Sólo crecerán:

Las bacterias capaces de

utilizar alfa conidendrina
se desarrollarán en colonias
Consiste en obtener un solo M.O.
a partir de una gota suspendida.

Se necesita un equipo especial

Como un micromanipulador
Adaptable al microscopio.
Este aparato permite al operador
controlar los movimientos de
una micropipeta o microcánula

Dentro del tubo y pasarla a un

medio de cultivo para
su desarrollo.
Esta técnica se
usa en estudios
muy
especializados
 Mantenimiento y preservación de
cultivos puros.

Uno de los problemas del estudio de los

cultivos puros es su mantenimiento en
condiciones viables por varios periodos

La mayoría de los laboratorios de

bacteriología cuentan con una gran
variedad de cultivos puros ( colección
de cultivos).
Estos cultivos puros de M.O. se
necesitan para las clases de
laboratorio y trabajos de
investigación.

Es muy importante tenerlas

perfectamente identificadas las
bacterias de los cultivos puros
listos para usarse.
Las compañías industriales tienen
colecciones de cultivos
bacterianos.
1.Para probar la efectividad de
agentes químicos y
quimioterapéuticos.

2.Como agentes de ensayo para

antibióticos y vitaminas.
 No todas las bacterias
responden a condiciones
específicas de crecimiento.

Lo que es apropiado para un

cultivo no puede ser aplicable
para otro.
Es esencial que el método de
preservación y mantenimiento conserve
todas las características de las
especies tal como fueron en el
momento de la preservación :

Los cultivos pueden mantenerse en tubos por

algún tiempo mediante resiembra
periódica en medios frescos
 Para utilizar este método se debe de
considerar:

El medio de cultivo apropiado

para usarlo con cada cultivo.

Temperatura apropiada para

mantener los cultivos.

Tiempo que se necesita para

hacer la resiembra.
 Tiempo de T° de Almacenam
M.O. Medio resiembra incubación iento

Salmonella sp. Agar cisteína 1 mes 35° 35°C

Bacillus Sp
Agar nutritivo 12 ó más 28° 10°C
Seudomona Sp. Agar nutritivo 3 meses 28° 10°C
Clostridium Sp. 6 meses ó
Carne cocida
más 28° 10°C
La liofilización es el procedimiento más eficaz
para la preservación de cultivos.

Muchas especies de bacterias procesadas por

esta técnica han permanecido viables por más
de 20 años.

En este procedimiento las células se secan

rápidamente mientras son congeladas
mediante las siguientes etapas:
La suspensión de células se ponen
pequeños frascos que se sumergen en
una mezcla de hielo seco y alcohol (-
78°C).
Los frascos se conectan inmediatamente
a una línea a alto vacío.

Una vez que se termina el secado

cada frasco se sella bajo condiciones
de vacío.
 Las ventajas:
La gran longevidad de los
cultivos

Los pequeñísimos cambios en

las características de las células

Por ser pequeño el recipiente

donde se almacenan ocupan
poco espacio.
 Rotule el tubo con, el nombre del germen que va inocular y la
flecha en que se hace el inoculo.

Con
. la mano derecha tome la aguja de inoculación y
flaméela; sin soltarla, déjela enfriar

Sostenga el tubo con el cultivo en la mano

izquierda, remueva el tapón con el meñique
de la otra mano y sosténgalo de tal manera
que no toque ninguna superficie.

Flamee la boca del tubo

Retire una porción de cultivo.
Flamee nuevamente la boca del
tubo y tape .
Incube a 37
ºC por 24 a
En el tubo a inocular, inocúlelo,
Flamee de nuevo la boca 48 horas
haciendo una estría en su
del tubo, tápelo y colóquelo
superficie.
en la gradilla
 cultivos en agar recto

Se debe de usar la aguja de siembra recta

desde la superficie al fondo del tubo y
retirarla por el mismo lugar que se
introdujo.
Los tubos de caldo

se pueden sembrar con el asa.

Después de la siembra e incubación se
pueden determinar características más
peculiares de desarrollo en el cultivo.
Una de las características principales de
las bacterias es su apariencia como:

Aspecto, color, cromogénesis,

abundancia de crecimiento, olor del
cultivo, que sirven de guía su
identificación.
En un cultivo puro se
observa los siguientes
aspectos de cultivo:
1º. Tipo de colonias : En agar (cultivo placa).

2º. Desarrollo: En agar inclinado.

3º. Desarrollo: En caldo.

4º Desarrollo: En gelatina por picadura

 Desarrollo de las colonias en agar placas.
1º Tamaño.
Los límites de tamaño de las colonias varían
desde muy pequeñas (punta de alfiler)
hasta colonias muy grandes que miden 5 ó
10 mn de diámetro.

La mayoría de las bacterias forman

colonias de tamaño limitado

Otras como Pseudomonas se desarrollan

sobre toda la superficie del agar.
2º. Márgen o borde.
Son de diferentes tipos: Pueden formar un círculo
perfecto como los bordes de una gota

Mostrar irregularidades como salientes redondas

hendiduras, proyecciones filiformes o proyecciones
en forma de raíz.

3º. Elevación.
Pueden ser muy finas (aplanadas) o gruesas
(elevadas), las colonias elevadas muestran
diferentes grados de convexidad.
Morfología de las colonias
4º. Cromogénesis o pigmentación.
Las colonias pueden estar coloreadas
(pigmentadas) o sin color no
pigmentado, algunas especies se
caracterizan por lo matices rojo,
amarillo, café, violeta).

5º. Características ópticas.

Las hay opacas, transparentes u
opalescentes.
 Desarrollo en agar
inclinado
1º. Cantidad. Escoso moderado o
abundante.

2º. Margen o borde de desarrollo

uniforme que incluso presenta varias
irregularidades en cierta forma
similares a las colonias
desarrolladas en placas.
3º. Textura igual que las
colonias.
Consistencia mantecosa o de mantequilla
fácilmente removible con una aza de siembra.

Viscosa o filamentos secos Si forma o no

emulsión fácilmente cuando se pone en una
gota de agua.

4º. Cromogénesis o pigmentación.

Similar al de las colonias en placas.
 La cromogénesis o pigmentación.

No todas las especies bacterianas poseen

estas características de distinción.

Algunas especies productoras de pigmento,

lo retenido dentro de las células de manera
que la masa de células bacterianas se
colorea

Mientras que en otras el pigmento lo excreta

y lo que se colorea es el medio de cultivo.
La intensidad de la coloración está
influido por la composición del medio y
las condiciones de incubación.

La producción de pigmento se observa

mejor en los medios de cultivos sólidos.

Algunas de las especies bacterianas

retienen pigmento intracelular son:
Serratia marcescens rojo

St. Aureus amarillo dorado

Serratia lutea amarillo limón

Micrococus amarillo

Algunas de las bacterias que producen

pigmentos y lo escretan al medio son:

Pseudomonas flourescens verde café olivo

P. aeroginosa verde azul o café oscuro

 Desarrollo en caldo nutritivo.

1º. Cantidad de desarrollo escaso moderado o

abundante.

2º. Distribución del desarrollo en el caldo.

Uniformemente distribuido (turbidez)
uniforme desarrollo confinado a la
superficie del caldo como nata o película
fina o gruesa, o desarrollo que se acumula
como sedimento que es granular o
viscoso.

3º. Olor. Putrido, aromático, imperceptible.

 Ácido de la Glucosa
Muchas de las bacterias usan la glucosa como fuente de carbono, como parte
importante de su metabolismo.

Se determina si la bacteria usa la glucosa produciendo ácido y/o gas a partir de

dicho carbohidrato.

En un tubo con agua peptonada al 1% de glucosa

y un tubo de Durhjam, se inocula la bacteria
por agitación teniendo
Luego se incuba por 24 horas a 37°C
Si la bacteria usa la glucosa producirá ácido
y/o gas

Si produce gas, se observará una burbuja en la

campana de Durhjam.

(+) Ácido y gas a partir de la glucosa: Escherichia coli