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(light scattering)
Matías Möller
Fisicoquímica Biológica
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Dispersión de luz
• Por qué el cielo es azul?
• Cómo se ve el cielo de la luna?
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Dispersión de luz
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Dispersión de luz
El fotón incidente induce un dipolo oscilante en la nube electrónica.
Al cambiar el dipolo, la energía se irradia-dispersa en todas direcciones.
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Dispersión de luz por proteínas
• Intensidad de luz dispersada es proporcional a la masa
molecular y concentración
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Dispersión de luz por proteínas
Se puede analizar de diferentes maneras:
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Dispersión de luz estática
• Medida de masas moleculares
Intensidad promedio de dispersión es función de la masa
molecular y el 2do coeficiente virial
Factor de forma,
= 1 si r < 60 nm
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Dispersión de luz estática
• Gráficos de Debye:
Preparar un número de concentraciones de la proteína en un
buffer apropiado
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Dispersión de luz estática
Ecuación de Rayleigh
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Dispersión de luz estática
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Dispersión de luz estática
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Dispersión de luz estática
2do coeficiente virial
• Propiedad termodinámica que describe la fuerza de
interacción entre la molécula y el solvente
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Dispersión de luz estática
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Dispersión de luz estática
Masa molecular de proteínas
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Dispersión de luz estática
Medidas
• En batch/cubeta
• En línea combinado con un paso de
fraccionamiento, principalmente
Cromatografía de exclusión molecular
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Dispersión de luz estática
La masa molecular medida en experimentos de dispersión son
MM promediada por el peso (fracción en g)
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Dispersión de luz estática
Para determinar MM individuales:
• Fraccionar la muestra
• Combinar medidas de dispersión con un paso
de fraccionamiento SEC / MALS
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Dispersión de luz estática
(índice de refracción)
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Dispersión de luz estática
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Dispersión de luz estática
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Dispersión de luz estática
(índice de refracción) 23
Dispersión de luz estática
• Señal de dispersión Rq α MM C
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(índice de refracción) 25
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Dispersión de luz estática
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Dispersión de luz estática
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Dispersión de luz estática
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Dispersión de luz estática
• Pros
Determinacion de MM rapida y exacta (promedio) de macromoleculas en solución
Combinando SEC-MALS se puede determinar MM con una precision ± 5%
Dependencia angular de señal de LS detecta agregados
SEC-MALS permite detectar y cuantificar poblaciones de proteinas según sus MM
Puede determinar estado oligomerico de polipeptidos modificados (prot-acidos
nucleicos, glicosilados, etc.
• Contras
Mide MM promedio, necesita separación para distinguir estados oligoméricos
Posible perdida de muestra durante filtración y fraccionamiento
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Dispersión de luz Dinámica
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Dispersión de luz Dinámica
DLS
Permite determinar el tamaño
de moléculas y nanopartículas
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Dispersión de luz Dinámica
Fluctuaciones son resultado del movimiento browniano y puede
correlacionarse con el coeficiente de difusión y el tamaño
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Dispersión de luz Dinámica
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Dispersión de luz Dinámica
• Las fluctuaciones en la intensidad no son al azar, sino consecuencia
del confinamiento de las partículas a sitios cercanos a la posición
inicial en tiempos muy cortos
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Autocorrelación
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correlograma
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Dispersión de luz Dinámica
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Dispersión de luz Dinámica
Pros
• En cubeta, muy rápida detección de agregados y evaluación de la
polidispersión de la muestra con un amplio rango dinámico
• Adecuado para estudiar cinética de agregación
• Detector disponible para placas, parara screening
Contras
• Mide radio hidrodinámico, es cual es afectado por la forma de la
partícula
• No puede distinguir entre cambios de forma o estado de
oligomerización
• Necesita fraccionamiento para resolver oligómeros presentes en
una mezcla
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Bibliografía
• Protein sizing by light scattering, molecular weight and
polydispersity, Malvern Instruments presentation,
http://nanoparticles.org/pdf/nobbmann.pdf
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