Клонирование

ДНК
Что такое клонирование ДНК???

- процесс выделения заданной

последовательности ДНК и получения
многих её копий
 Для чего клонируют ДНК???

 получение большого количества копий

представляющего интерес
гена/фрагмента гена/участка ДНК

 получение представляющих интерес

белков

Создание молекулярных библиотек

Генная терапия
 Как можно клонировать ДНК???

Существует два подхода к клонированию

ДНК.

Первый подход предполагает

использование бактериальных или
дрожжевых клеток для размножения
введенной в них чужеродной ДНК.

 Второй способ представляет собой

амплификацию ДНК in vitro.
 ДНК человека

Плазмида –
Ген для
Расщепление вектор для
клонирования
рестриктазами клонирования

Рекомбинантная ДНК –
это молекула ДНК Лигирование

содержащая Рекомбининтная
ДНК
двуцепочечные
фрагменты разного Генетическая трансформация

Клетка -
происхождения хозяин

Клонирование

Экспрессия
гена человека
Основные вехи в развитии технологии рекомбинантных ДНК

1869 Мишер впервые выделил ДНК

1944 Эвери установил генетическую роль ДНК
1953 Уотсон и Крик предложили модель ДНК
1955 Корнберг открыл ДНК-полимеразу
1961 Мармур и Доти открыли явление ренатурации ДНК
1962 Арбер открыл ферменты рестрикции
1966 Ниренберг, Очоа и Корана расшифровали
генетический код
1967 Геллерт открыл ДНК-лигазу
1972-1973 Бойер,Коэн и Берг разработали технологию
клонирования ДНК
1975-1977 Сэнгер и Баррел, Максам и Гилберт разработали
методы определения нукл. послед. ДНК
1990-2003 Программа Геном человека
 Компоненты необходимые для
клонирования in vivo
- ДНК для клонирования: ФР, кДНК
- Вектор для клонирования:
- молекула ДНК способная выжить в чужой клетке
- способна переносить чужеродные фрагменты ДНК
- способна реплицироваться самостоятельно

- Ферменты рестрикции - рестриктазы

- Клетка-хозяин
- Система скрининга клеток
- Набор ферментов для работы с ДНК
 Этапы клонирования in vivo
1. Выделение необходимого фрагмента и векторной
ДНК
2. Расщепление фрагмента ДНК и вектора при
помощи рестриктаз
3. Лигирование фрагмента ДНК и ДНК вектора

4. Генетическая трансформация – внедрение

рекомбинантных молекул в клетку - хозяин
5. Клонирование молекул при помощи репликации in
vivo
6. Экспрессия гена и получение белка

7. Скрининг трансформированных клеток

 Выделение и очистка ДНК
• Быстрый лизис клеток – достигается
использованием буферных растворов с
денатурирующими агентами

• Центрифугирование и удаление фрагментов

органелл и мембран

• Ферментативное разрушение белков

• Экстракция разрушенных белков из раствора с

помощью фенола и хлороформа

• Осаждение ДНК в этаноле

 Рестрикция ДНК на фрагменты
основана на использовании специальных ферментов –
рестриктаз, обладающих эндонуклеазной активностью
рестриктазы выделяют из бактерий, где они являются
природным средством защиты от вирусов
известно более 500 рестриктаз
каждая рестриктаза распознает сайт рестрикции -
специфическую палиндромную последовательность из 4-
6-8 п.н., которые располагаются обычно в некодирующих
участках
длины полученных в результате рестрикции фрагментов
видоспецифичны, что используется для составления
рестрикционных карт
Получение рестриктных фрагментов
при помощи рестриктаз
СР
BamH I
Определение
СР СР BamH I СР Hae III
СР Hae III

Расщепление при
помощи ФР BamH I Hae III

Рестриктные
фрагменты (РФ)

РФ1 Липкие концы РФ2 Липкие концы РФ3

Сайты, узнаваемые разными
рестриктазами
ДНК человека

Плазмида –
Ген для
Расщепление вектор для
клонирования
рестриктазами клонирования

Лигирование

Генетическая трансформация

Клетка -
хозяин

Клонирование

Экспрессия
гена человека
 Cleavage of DNA by the restriction enzyme

EcoRI makes symmetrical cuts in DNA, leaving “sticky” ends. A DNA

fragment with a sticky end can bind by complementary base pairing
(anneal) to any other DNA fragment with a sticky end produced by EcoRI
cleavage. The gaps can then be sealed by DNA ligase.
 Векторы для клонирования
Длина клонируемого Клетка-
Вектор
фрагмента хозяин
До 10 kb (геномная ДНК, Бактерии,
Плазмиды
кДНК) дрожжи
До 25 kb (геномная ДНК, Бактерии
Бактериофаги
кДНК)
Космиды 30-45 kb (геномная ДНК) Бактерии

BAC (Bacterial artificial До 300 kb (геномная ДНК) Бактерии

chromosome)
YAC (Yeast artificial 0,2-2.0 Mb (геномная ДНК) Дрожжи
chromosome)

Вектор для клонирования:

- Содержит точку ori
- Может переностить чужие фрагменты (содержит СР)
- Содержит гены устойчивости к антибиотикам
Лигирование вставки в векторную ДНК
 Получение рекомбинантной ДНК
ДНК для клонирования ДНК – вектор для клонирования

Определение сайтов
рестрикции
СРBamH I СРBamH I СРBamH I

Расщепление при
помощи
рестриктазы
Необходимый фрагмент

РФ РФ РФ РФ РФ

Лигирование

Рекомбинантная
ДНК
ДНК человека

Клонирование
человеческих генов in vivo
Плазмида –
Ген для
клонирования
Расщепление
рестриктазами
вектор для
клонирования Проблемы
 Величина генома
человека;
Лигирование
 Регуляторные области
Рекомбининтная отличаются от
ДНК бактериальных;
 Содержат интроны,
Генетическая трансформация
которые не вырезаются в
Клетка -
хозяин
бактериальных системах.

Решение:
Клонирование
синтез кДНК на основе
Экспрессия
гена человека мРНК соответствующей
изучаемому гену
 Этапы получения кДНК
(комплементарной ДНК))

•Выделение Poly(A)+ РНК

•Гибридизация poly(A) с
oligo(dT)

•Синтез первой цепи кДНК при

помощи ревертазы

•Расщепление мРНК

•Синтез второй цепи ДНК при

помощи ДНК-полимеразы
На основе технологии рекомбинантной ДНК создают
генные коллекции – банки и библиотеки клонов

Различают несколько типов библиотек:

1. Геномная библиотека
2. Хромосомные библиотеки
3. Библиотеки кДНК
 Библиотеки генов
•Геномные библиотеки – содержат
последовательности всего генома организма

•Библиотеки кДНК – содержат фрагменты

ДНК соответствующих мРНК клетки / ткани

•Хромосомные библиотеки – содержат

фрагменты определенной хромосомы
 Этапы получения
геномных библиотек

•Выделение геномной
ДНК

•Рестрикция ДНК

•Лигирование
рестриктных
фрагментов с вектором

•Генетическая
трансформация

•Селекция клонов
 Этапы получения библиотек кДНК
•Выделение мРНК

•Синтез кДНК

•Лигирование
линкеров к концам

•Рестрикция кДНК
и вектора
•Лигирование
кДНК-вектор
•Генетическая
трансформация
•Селекция клонов
 Клонирование in vitro – ПЦР
(полимеразная цепная реакция)
PCR (polymerase chain reaction)

Лауреат Нобелевской
премии по химии 1993 года
Кэри Мюллис (Kary Mullis)

История открытия ПЦР-амплификации ДНК –

блестящий пример эпохального изобретения,
сделанного гениальным одиночкой; причем
идея осенила изобретателя мгновенно и, как
кажется, абсолютно непредсказуемо.
 Компоненты необходимые для ПЦР

- ДНК для анализа

- Специфичные праймеры
- Taq-полимераза
- dNTP
- Аппарат для контроля температуры:
- tº денатурации ДНК
- tº отжига праймеров
- tº для полимеризации ДНК
 Этапы ПЦР
A. Приготовление реакционной смеси

B. Денатурация – ренатурация – элонгация 30-35 цикла

•Денатурация ДНК при 96oC

•Охлаждение до температуры отжига праймеров
•Элонгация при 72oC
C. Изучение амплифицированных фрагментов
- Электрофорез
- Окрашивание
- интерпретация результатов
 Клонирование ДНК = многократная
репликация

in vivo in vitro
• Рекомбинантная  ПЦР / PCR
ДНК  В искусственных
• Необходима клетка- условиях
хозяин  Репликация с
• Необходим вектор использованием
содержащий ori искусственных
• Есть возможность компонентов
получения белка
Практическая роль анализа ДНК:
1. Научная – секвенирование ДНК, получение
библиотек генов, изучение экспрессии генов, изучение
контроля экспрессии, определение мутаций.

2. Определение носителей мутаций – предупреждение

рождения детей с серьезными нарушениями.

3. Генная терапия (внедрение нормального гена в геном

носителя мутации).
4. Определение чужеродной ДНК (вирусной,
бактериальной) при диагностике инфекций.
5. Определение индивидуального полиморфизма при
филиации, в криминалистике.
 Медицина XXI века - Молекулярная
Медицина
• Понимание механизмов болезней на
клеточном уровне
• Создание клеточных и генно-инженерных
технологий
• Разработка концепции
запрограммированной гибели клеток
• Расшифровка генома человека

32