UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA BIOLÓGICA Y FISIOLOGÍA
ANIMAL

MÉTODOS INSTRUMENTALES DE ANÁLISIS

T.1. Electroforesis: Definición. Fundamento. Elementos. Factores que afectan la

movilidad de las macromoléculas.
T.2.Condiciones y requerimientos para el corrido electroforético: Medios de
soporte. Colorantes.

Ms.C. Patricia Elizabeth Torres Plasencia

 ELECTROFORESIS
La electroforesis es una técnica para la
separación de moléculas según la movilidad
de estas en un campo eléctrico a través de
una matriz porosa, la cual finalmente las
separa según su tamaño molecular, forma
(estructura tridimensional) y carga eléctrica,
dependiendo de la técnica que se use. Es un
método analítico (identificación y
caracterización física de las biomoléculas),
preparativo (separación de las biomoléculas),
fue empleado por primera vez por Tiselius en
el año 1937.
 Fundamentos…………

Cuando una mezcla de moléculas

ionizadas y con una carga eléctrica neta
son colocadas en un campo eléctrico,
éstas experimentarán una fuerza de
atracción (fuerza del campo
eléctrico) hacia el polo que posea carga
opuesta. Si se deja transcurrir un cierto
tiempo las moléculas con carga
positiva se desplazarán hacia
el cátodo (el polo negativo) y aquellas
con carga negativa se desplazarán hacia
el ánodo (el polo positivo).
Aparte de la fuerza del campo
eléctrico, el movimiento de las
moléculas está gobernado también
por dos fuerzas adicionales: la fricción
con el medio dificultará este
movimiento originando una fuerza que
se opone y por otro, lado las moléculas
se mueven en forma aleatoria o
movimiento browniano debido a que
poseen energía cinética propia, lo que
se denomina como difusión (la energía
cinética aumenta con el aumento de la
temperatura, a mayor temperatura,
mayor difusión). Para evitar el
problema de la difusión, se usan
soportes sólidos: gel (agarosa,
poliacrilamida) o papel.
Cada molécula se desplaza por efecto del
campo eléctrico, alcanzando rápidamente
una velocidad constante al equilibrarse la
fuerza impulsora (fuerza del campo
eléctrico) con la resistencia al avance
(fuerza de fricción o rozamiento) impuesta
por el medio en el que se desplaza.
La velocidad de migración (v) de la
partícula será:
La separación se logra en base a:
1. La carga.
2. El tamaño (masa molecular).
3. La forma.

V: velocidad de migración de la partícula.

q: carga efectiva (depende del pH).
E: gradiente de potencial eléctrico (E= Voltaje/distancia).
f: coeficiente de fricción (relacionado al tamaño y forma de la
biomolécula, así como a la viscosidad del medio).

La velocidad de migración electroforética depende de la densidad de carga de la molécula

(relación carga/masa), también del voltaje aplicado y de la porosidad del gel de
electroforesis.
La velocidad de la molécula cargada, por unidad de campo eléctrico, recibe el nombre
de movilidad electroforética, μ. Es un caso particular de la velocidad de migración de un
ión, cuando se aplica un campo eléctrico de 1 V/cm. Su signo es igual al de la carga de la
partícula:

μ = V/ E = q / f

Como μ depende del coeficiente de fricción, nos proporciona información sobre la forma y
tamaño molecular.

La mayoría de las biomacromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos) poseen

determinada carga eléctrica con grupos aniónicos y catiónicos capaces de disociarse. La
carga neta de la partícula está dada por el pH del medio y puede ser modificada por la
interacción con pequeñas moléculas de iones (fuerza iónica) u otras macromoléculas. De
lo anterior se deduce que el pH influye sobre la velocidad de migración de las moléculas.
En el punto isoeléctrico de la biomolécula, pH al cual su carga neta es 0, esta no migra. Por
debajo del punto isoeléctrico tiene carga neta positiva y migra hacia el cátodo, y por
encima del punto isoeléctrico tienen carga neta negativa y migra hacia el ánodo.
 TIPOS DE ELECTROFORESIS
Según el medio de separación:

• De frente móvil o libre: Los

componentes de la muestra están
presentes en toda la disolución
(buffer) y se determina ópticamente
la posición del frente de avance.
Escasa resolución, se requiere de
mucha muestra y aparatos
sofisticados para seguir la migración
de las moléculas. Ya no se usa.

• Zonal: La muestra se aplica como

una mancha o banda y sus
componentes migran a través de
un soporte sólido sumergido en el
solvente (buffer). En este caso no se
determina la movilidad, sino que el
único objetivo de la técnica es
separar los componentes de la
muestra.
• Electroforesis capilar:

Es una técnica automatizada, aunque la electroforesis zonal, especialmente en gel, en

sus diversas formas resulta un método común y efectivo para la separación de
moléculas, el proceso de separación puede durar varias horas, siendo difícil de
cuantificar y automatizar.
La técnica aquí presentada se lleva a cabo en el interior de tubos capilares (1–10 μm de
diámetro). Estos capilares disipan el calor rápidamente permitiendo la aplicación de
campos eléctricos elevados, reduciendo así los tiempos de separación.
Tipos de soporte usados en la electroforesis zonal:

En algunos soportes (papel o similares) la muestra queda sobre la superficie y avanza a lo

largo de ella, con escasa fricción, por lo que el mecanismo principal de separación es la
magnitud de la carga de cada componente de la muestra. Otros medios de soporte
(“geles”, medios semisólidos o gelatinosos) están formados por polímeros que forman una
malla, matriz o red tridimensional a través de la cual deben avanzar las moléculas de la
muestra, que queda embebida en el medio de soporte electroforético. Como
consecuencia, la fricción es notable y los factores de forma y tamaño adquieren una alta
relevancia en la separación.
Papel: Sencillo, pero con elevada adsorción debido a los grupos hidroxilo de la celulosa.
Se emplea en la separación de moléculas con baja masa: aminoácidos, péptidos. Se
requieren tiempos de separación largos (12 a 18 h). La visualización se logra con
ninhidrina. Se aplica alto voltaje para reducir la difusión y favorecer la separación.

Acetato de celulosa: Los grupos –OH están acetilados, lo que reduce la adsorción; es
apolar, presenta baja tinción de fondo; es posible transparentarla o disolverla para
detectar y recuperar, respectivamente, los componentes separados. Mayor resolución
que el papel. La separación es más rápida que en papel (30-60´). Desventaja: pueden dar
lugar a la electroendósmosis.
Gel de almidón: Pasta de almidón cuyos granos se han disgregado en un tampón
caliente (se hinchan). Actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la
poliacrilamida.

Gel de agarosa: Polisacárido, producto purificado de algas (composición similar al

agar-agar). Se disuelve en caliente (50-60°C) y al enfriar solidifica formando un gel, de
alta porosidad (el tamaño de los poros varía en función de la concentración). Para la
separación de proteínas y especialmente ác. nucleicos. Es más frágil que la
poliacrilamida.

En los geles (agarosa, poliacrilamida) la

separación no solo se basa en la carga, sino
también en la forma y tamaño.
 Gel de poliacrilamida: El gel es el resultado de la polimerización química de una
mezcla de acrilamida y bisacrilamida (proceso que requiere persulfato de amonio y
TEMED). Regulando la concentración de ambas y su proporción se consiguen
distintas porosidades, siempre menores que la de los geles de agarosa. Se pueden
preparar geles con gradiente de tamaño de poro (las moléculas van encontrando en
su migración un tamaño de poro más pequeño) y con gradiente de pH. A mayor
concentración, menor tamaño del poro. ES NEUROTÓXICO.

La electroforesis con este tipo de gel, se denomina

PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida).
Agarosa más poliacrilamida: Se consigue una porosidad intermedia.

Poliacrilamida con SDS: El dodecilsulfato sódico (Sodium Dodecyl Sulphate) es un

detergente aniónico, que se une a las proteínas desnaturalizándolas en una conformación
extendida recubierta de moléculas de SDS. Como consecuencia, el tamaño de la molécula
de proteína es directamente proporcional a su longitud en aminoácidos y su carga queda
enmascarada por la carga del SDS que la recubre, que es también proporcional a la
longitud. Por lo tanto, la movilidad electroforética de la proteína depende
exclusivamente de su masa molecular.
Según la disposición de los soportes:
Horizontal
En papel, para aminoácidos u otras moléculas pequeñas; en soportes similares
(especialmente, acetato de celulosa), para proteínas.
En gel de almidón o de agarosa, para proteínas y especialmente para ácidos nucleicos.
Casi siempre el tampón cubre el gel (para evitar que se seque debido al calentamiento
sufrido al pasar la corriente), denominándose por ello “electroforesis submarina”.
El soporte se impregna por capilaridad de disolución tampón, que disuelve la muestra y
mantiene el contacto eléctrico.
Se aplica la muestra depositándola (con pipeta o un aplicador específico) como una
gota sobre el soporte (papel, acetato de celulosa) o dentro de un “pocillo” creado en el
gel.

En papel En gel de agarosa

Vertical
Se usa casi exclusivamente con gel de poliacrilamida (más resistente físicamente, no se
desliza), para proteínas o para ácidos nucleicos de pequeño tamaño.
El gel puede rellenar tubos de vidrio (este formato ya apenas se usa) o estar contenido
entre 2 placas rectangulares.
Contacto eléctrico y disolvente gracias al tampón que embebe el gel y llena las cubetas o
compartimentos del ánodo y cátodo.
La muestra se deposita con micropipeta llenando un “pocillo” creado al polimerizar el gel.
COMPONENTES DE UN EQUIPO DE ELECTROFORESIS
Fuente de poder: Fuente de alimentación.
Proporciona el campo eléctrico mediante dos
electrodos, uno positivo (ánodo) y otro negativo
(cátodo) entre los que se establece una
diferencia de potencial.

Cubeta: Recipiente en
cuyos extremos se sitúan
los electrodos.

Soporte o gel de separación

o resolución.

Gel acumulador o de concentración:

Buffer de corrido: Es de la misma composición y pH que el buffer con el

que se prepara el gel de resolución, ya sea de agarosa o de acrilamida.
Éste proporciona el medio para la transmisión de la corriente eléctrica y
mantiene el pH sin variaciones mientras se realiza el corrido.
Buffer de carga de la muestra: Este amortiguador tiene como fin brindar peso,
densidad y color a la muestra, lo que facilita su depósito en el pocillo y evita su salida
del gel; permite, además, monitorear el corrido de la muestra en el gel. Se emplea en
relación 1:3 para ácidos nucleicos o 1:6 para proteínas, respecto a la cantidad de
muestra.

PROCEDIMIENTO GENERAL DE UNA ELECTROFORESIS

1. Preparar un gel de agarosa o poliacrilamida a la concentración

requerida.
2. Mezclar las muestras a analizar con un buffer de carga
adecuado.
3. Cargar las muestras en el gel.
4. Realizar la corrida electroforética al voltaje pertinente.
5. Visualizar los ácidos nucleicos o las proteínas.
 FACTORES QUE AFECTAN LA MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA

Campo eléctrico
Es un gradiente de potencial que posibilita que haya electroforesis. A su vez, depende de
diferentes parámetros:
• Diferencia de potencial (V). Se mide en voltios y es lo que define el campo eléctrico.
Cuanto mayor sea, mayor será la velocidad de migración. Las electroforesis se
consideran de bajo voltaje si se realizan entre 10-500 voltios (la mayoría) y de alto
voltaje si se realizan entre 500-10,000 voltios.
• Intensidad (I). Se mide en amperios y cuantifica el flujo de carga eléctrica. Está
relacionada con la diferencia de potencial por la Ley de Ohm: V=IR y para una diferencia
de potencial dada, su valor (normalmente entre 5-50mA) viene determinado por la
resistencia del soporte, por lo que, en última instancia, da cuenta de la distancia
recorrida por las moléculas.
• Resistencia (R). Se mide en ohmios y cuanto mayor sea la resistencia del soporte,
menor será la movilidad electroforética (ya que la intensidad ha de ser menor para
que se cumpla la Ley de Ohm). Depende de la naturaleza del soporte, sus
dimensiones (ancho, longitud y sección) y de la concentración del tampón de
electroforesis.
• Temperatura. Por el efecto Joule, el paso de una corriente eléctrica produce calor,
y este efecto será tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia de potencial y la
resistencia del sistema. Debe controlarse de forma estricta, puesto que puede
afectar a la muestra (desnaturalizándola), al soporte e incluso al equipo
electroforético. Todo esto justifica, por sí solo, la necesidad de un sistema de
refrigeración en las cubetas de electroforesis.
Muestra
La movilidad electroforética de una molécula es tanto mayor cuanto mayor sea su carga
y disminuye según aumenta su tamaño, ya que mayor es la fricción de la molécula con
el medio y menor es su carga por unidad de superficie. Por esta razón, las moléculas
globulares se mueven con mayor facilidad que las elongadas, ya que la esfera presenta
la mínima superficie a igualdad de volumen. Así, moléculas del mismo tamaño y carga,
pero de diferente forma, pueden tener una movilidad electroforética diferente y ser,
por tanto, separables mediante una electroforesis.

Aplicación de la muestra
en electroforesis vertical.
Aplicación de la muestra en electroforesis horizontal.
Tampón
Durante una electroforesis, se produce una electrolisis del agua por acción del campo
eléctrico, lo cual genera protones en la proximidad del ánodo e iones hidroxilo en el
cátodo. El tampón es, por esta razón, esencial durante la electroforesis para evitar que
el ánodo se acidifique y el cátodo se haga más básico, pero no debe afectar a las
moléculas a separar. Además, la fuerza iónica condiciona la movilidad electroforética de
las sustancias a separar, ya que influye en su esfera de solvatación y en la conductividad
de todo el sistema, por lo tanto, es necesaria una fuerza iónica suficiente para
mantener el pH y la conductividad durante todo el proceso, pero no muy elevada, ya
que llegaría a interferir en el sistema. Normalmente, se emplean tampones con fuerzas
iónicas moderadas (0,05-0,10M), siendo el pH la característica que debe ser más
controlada, puesto que determina la carga de la muestra. Conviene señalar también
que atendiendo a la distribución del tampón, los sistemas se clasifican en continuos
cuando se emplea un único tampón en el proceso, y discontinuos cuando se emplean,
al menos, dos tampones de pH y composición diferentes.
Soporte
La simple presencia del soporte en una electroforesis hace que se presenten una serie
de fenómenos de elevada trascendencia para el resultado del proceso:
• Adsorción. Es una retención inespecífica de las moléculas de la muestra sobre el
soporte, por lo que afecta negativamente a la resolución, ensanchando las bandas de
migración.
• Tamaño del poro (tamiz molecular).
• Electroendósmosis (EEO).
• Electroendósmosis (EEO). Es un fenómeno que se da en algunos soportes (papel,
acetato de celulosa y agarosa), en los que aparecen cargas negativas, debido a grupos
carboxilo o sulfato, al estar en contacto con una disolución iónica. Al aplicar el campo
eléctrico, los iones y las moléculas se desplazan según su carga, pero en su migración se
encuentran con un flujo de cationes desplazándose sobre la superficie del soporte y
otro de aniones haciéndolo por el centro de los poros. Este flujo orientado se llama
flujo electroendosmótico. El flujo EEO va en contra de la resolución de una
electroforesis, ya que las bandas de la muestra se ensanchan y se distorsionan; sin
embargo, la EEO contribuirá a una mejor resolución en las inmunoelectroforesis y en la
electroforesis.

Las cargas más cercanas al medio de soporte con carga negativa, son inmóviles, mientras
que las más alejadas son más móviles; estas últimas, al moverse hacia el electrodo
correspondiente, generan un desplazamiento del solvente (buffer), arrastrando las
moléculas no cargadas o débilmente cargadas.
 PROPIEDADES DE LA ELECTROFORESIS

Es de destacar que a escala analítica, los métodos electroforéticos son de alta

sensibilidad, poder de resolución y versatilidad, y sirven como método de
separación de mezclas complejas de ácidos nucleicos, proteínas y otras
biomoléculas, donde aportan un potente criterio de pureza.

Se pueden conocer también mediante estas técnicas, las características ácido-

básicas de las proteínas presentes en un extracto crudo, lo que da la información
necesaria si se pretende realizar una separación cromatográfica basada en
diferencias de carga (cromatografía de intercambio iónico).

Es útil además para determinar otros parámetros como peso molecular, punto
isoeléctrico y número de cadenas polipeptídicas de las proteínas.